Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) абортного материала

Потеря беременности относится к наиболее частым осложнениям ранних сроков. Около 10% клинически распознанных беременностей заканчиваются ранней потерей, и приблизительно половина таких случаев связана с хромосомными нарушениями эмбриона. Наиболее распространены анеуплоидии, возникающие вследствие ошибок расхождения хромосом при образовании половых клеток или на ранних этапах эмбрионального развития. Вероятность таких нарушений увеличивается с возрастом женщины, поскольку с возрастом ооцитов возрастает частота ошибок мейотического деления. Хромосомная аномалия способна прекратить развитие беременности ещё до формирования выраженных анатомических изменений эмбриона: дополнительная хромосома, отсутствие одной из её копий, изменение количества полного хромосомного набора или крупная несбалансированная перестройка нарушают нормальное соотношение множества генов, одновременно участвующих в развитии плаценты, нервной системы и внутренних органов. Поэтому исследование ткани после потери беременности позволяет установить, был ли конкретный эпизод связан с хромосомным нарушением эмбриона или плода.
Если обнаруженная аномалия возникла спорадически (случайно), исследование объясняет произошедшую потерю и позволяет отделить её от ситуаций, в которых требуется искать другие механизмы невынашивания. Если характер перестройки указывает на возможное родительское носительство структурной аномалии, результат становится основанием для обследования пары и индивидуальной оценки репродуктивного риска. При повторных потерях беременности генетическое исследование абортного материала также отвечает прежде всего на вопрос о причине конкретного эпизода.
Хромосомный микроматричный анализ исследует ДНК абортного материала и определяет изменения количества генетического материала без необходимости выращивания клеток в культуре. В данном исследовании используется SNP-олигонуклеотидная микроматрица: наряду с количеством копий отдельных хромосомных участков оценивается распределение генетических вариантов, что расширяет возможности исследования по сравнению с анализом одной копийности. Лаборатория заявляет выявление анеуплоидий, триплоидии, полногеномной однородительской дисомии и микроделеций или микродупликаций размером более 800 kb. Качество результата зависит от происхождения исследуемой ткани. Преобладание материнского материала способно изменить генотипический профиль, а мозаичное нарушение, локализованное преимущественно в другом участке тканей беременности, не обязательно будет представлено в исследуемом образце. Морфологический отбор ткани и SNP-контроль материнской контаминации уменьшают эти риски, но не отменяют биологическую неоднородность абортного материала.

Что выявляет исследование и как интерпретировать результат

Числовые аномалии хромосом

Анеуплоидия возникает при изменении количества отдельных хромосом. В нормальном диплоидном наборе каждая аутосома представлена двумя копиями; появление третьей копии формирует трисомию, утрата одной из двух копий, моносомию. Вместе с количеством хромосом меняется число копий всех расположенных на них генов, что нарушает согласованную программу эмбрионального развития. 
Трисомии составляют основную часть хромосомных находок при ранних спонтанных потерях. Одной из наиболее частых является трисомия 16, полная форма которой практически несовместима с продолжительным внутриутробным развитием. Трисомии 21, 18 и 13 также обнаруживаются в абортном материале, хотя часть беременностей с этими анеуплоидиями продолжается до поздних сроков, а при трисомии 21 возможно рождение жизнеспособного ребёнка. 
Моносомии аутосом вызывают настолько выраженный дефицит генетического материала, что полные формы обычно прекращают развитие на очень ранних этапах. Существенное исключение составляет моносомия X, 45,X: часть таких беременностей продолжается, однако большинство заканчивается внутриутробной потерей, поэтому этот вариант регулярно выявляется при исследовании абортного материала. 
Большинство полных анеуплоидий возникает впервые у эмбриона вследствие ошибки расхождения хромосом и не связано со сбалансированной хромосомной перестройкой у родителей. Обнаружение такой анеуплоидии объясняет конкретную потерю, но не означает, что вероятность повторения равна некоторому универсальному «общепопуляционному риску». Для последующей беременности учитываются возраст женщины, репродуктивный анамнез и характер самой находки. Иная ситуация возникает, если структура обнаруженного дисбаланса допускает образование аномального хромосомного набора вследствие родительской перестройки. В таких случаях исследование абортного материала позволяет сформулировать показания к кариотипированию родителей, а не предполагать спорадическое происхождение изменения автоматически.

Полиплоидии

При полиплоидии изменяется количество не отдельной хромосомы, а целого гаплоидного набора. Для материала после потери беременности основное значение имеет триплоидия , при которой клетки содержат 69 хромосом: один полный дополнительный набор присоединяется к обычным материнскому и отцовскому наборам. Такое изменение грубо нарушает развитие эмбриона и плаценты и в подавляющем большинстве случаев приводит к прекращению беременности. Клиническая картина триплоидии существенно зависит от происхождения дополнительного набора. При диандрической триплоидии дополнительный хромосомный материал имеет отцовское происхождение. Для неё характерно более выраженное развитие трофобласта, а сам генетический профиль типичен для частичного пузырного заноса. При дигинической триплоидии дополнительный набор происходит от матери; плацента обычно развита слабее, а у плода формируется выраженная задержка роста. Эти генетические варианты имеют разное клиническое продолжение, поэтому SNP-генотипирование дополнительного набора даёт информацию, которую нельзя получить только из общего числа хромосом. Для данного исследования лаборатория прямо указывает возможность определить материнское или отцовское происхождение дополнительного генетического материала. Диандрическая триплоидия и морфологически подтверждённый частичный пузырный занос тесно связаны, но эти понятия не следует механически отождествлять. Генетический результат сопоставляют с морфологией ворсин хориона и клиническими данными. При подтверждении частичного пузырного заноса после эвакуации ткани проводится динамическое исследование ХГЧ, поскольку сохраняющаяся трофобластическая ткань способна привести к постмолярной гестационной трофобластической неоплазии. После нормализации ХГЧ продолжительность наблюдения при частичном и полном заносе различается.

Полногеномное отцовское происхождение и полный пузырный занос

Большинство спорадических полных пузырных заносов имеет диплоидный андрогенетический геном: материнский ядерный генетический материал отсутствует, а оба хромосомных набора имеют отцовское происхождение. Чаще один сперматозоид оплодотворяет яйцеклетку без функционального материнского ядерного генома, после чего отцовский набор удваивается; реже в оплодотворении участвуют два сперматозоида. Такое происхождение генома резко нарушает нормальное соотношение материнских и отцовских импринтированных генов. Вместо нормального развития эмбриона возникает патологическая пролиферация трофобласта и гидропическая трансформация ворсин хориона. SNP-анализ способен обнаружить полногеномный отцовский генотип, а крупные серии исследований абортного материала подтверждают использование такого паттерна для выявления генетических признаков полного пузырного заноса. После подтверждённого полного пузырного заноса ХГЧ исследуют серийно до нормализации, затем наблюдение продолжают согласно протоколу для полного заноса.

Однородительская дисомия и участки отсутствия гетерозиготности

SNP-микроматрица оценивает не только количество ДНК, но и распределение аллелей. Благодаря этому выявляются протяжённые участки, в которых отсутствует ожидаемое сочетание разных материнских и отцовских вариантов. При нормальном количестве генетического материала такие изменения не выглядят как делеция или дупликация, однако их структура позволяет получить дополнительную информацию о происхождении хромосомных сегментов. 
Однородительская дисомия означает получение двух копий хромосомы или её части от одного родителя. Если обе копии идентичны, формируется изодисомия и возникает протяжённый участок отсутствия гетерозиготности. Клинические последствия определяются расположением такого участка. В областях геномного импринтинга родительское происхождение влияет на активность генов, а в других регионах изодисомия способна привести к присутствию двух одинаковых копий редкого рецессивного патогенного варианта. Микроматричный анализ при этом выявляет геномный паттерн, но не заменяет исследование последовательности конкретного гена. Поэтому обнаруженный участок гомозиготности способен указать область повышенного риска аутосомно-рецессивного заболевания, но сам по себе не устанавливает соответствующий моногенный диагноз. Множественные протяжённые участки гомозиготности, распределённые по разным хромосомам, свидетельствуют о повышенной доле генома, унаследованной от общих предков родителей. Такая картина увеличивает вероятность совпадения двух редких рецессивных вариантов у потомства, однако не позволяет по одному микроматричному результату устанавливать степень родства родителей или считать найденные участки непосредственной причиной потери беременности. 
Для абортного материала отдельное значение имеет полногеномное отцовское происхождение , поскольку оно соответствует генетическому механизму большинства полных пузырных заносов. Поэтому именно полногеномная ОРД, а не общий перечень синдромов импринтинга, представляет здесь наиболее значимую клиническую находку.

Хромосомные делеции и дупликации

При делеции утрачивается участок хромосомы вместе с расположенными в нём генами; при дупликации число копий этого участка увеличивается. Оба варианта изменяют генную дозу и способны нарушить эмбриональное развитие, если перестройка затрагивает гены, чувствительные к уменьшению или увеличению числа копий. Клинический эффект не определяется одним размером перестройки. Небольшая делеция, включающая критически важный для раннего развития ген, способна иметь более выраженные последствия, чем значительно более крупная дупликация другого региона. Поэтому найденный CNV оценивается по геномному положению, содержащимся в нём генам и известной связи данного участка с нарушениями развития. Крупные несбалансированные перестройки могут охватывать значительную часть хромосомы и затрагивать множество генов. Субмикроскопические делеции и дупликации имеют меньший размер и не различимы при обычном цитогенетическом исследовании, если находятся ниже его разрешающей способности. В конкретном ХМА абортного материала лаборатория заявляет обнаружение микроделеций и микродупликаций размером более 800 kb .

Диагностическое значение для семьи

Некоторые несбалансированные перестройки в тканях беременности возникают как результат сбалансированной структурной перестройки у одного из родителей . У носителя весь необходимый генетический материал сохранён, поэтому клинических проявлений может не быть; при образовании половых клеток перестроенные хромосомы способны распределяться неравномерно, и эмбрион получает избыток одного участка генома одновременно с дефицитом другого. Характерным признаком такого механизма служит сочетание терминальной делеции одной хромосомы и терминальной дупликации другой. В памятке лаборатории подобный результат также рассматривается как возможная несбалансированная транслокация и как основание для обследования родителей. Сама находка у эмбриона ещё не доказывает носительство перестройки у матери или отца, поскольку изменение способно возникнуть впервые. Кариотипирование родителей позволяет определить, является ли один из них носителем соответствующей сбалансированной транслокации. При подтверждённом носительстве оценка репродуктивного риска строится уже с учётом конкретной перестройки и механизма её наследования.

Контаминация материнскими клетками

Абортивный материал содержит ворсины хориона и другие ткани беременности, но рядом с ними присутствует материнская децидуальная ткань. Если в исследуемый образец преимущественно попадают материнские клетки, полученный генотип способен отражать геном женщины вместо генома эмбриона. Особенно трудно распознать такую ошибку при результате с женским набором хромосом: нормальный 46,XX без дополнительной генотипической информации может принадлежать как эмбриону женского пола, так и матери. Анализ крупных серий абортного материала показал, что материнская контаминация представляет существенную причину ошибочно нормальных женских результатов. SNP-генотипирование позволяет анализировать аллельные соотношения и выявлять присутствие материнской ДНК. Если однозначная идентификация невозможна, исследуется ткань, наиболее соответствующая плодному материалу.

Нормальный результат

Нормальный результат означает, что в исследованном образце не обнаружены хромосомные нарушения, доступные выявлению данным SNP-ХМА в пределах его аналитического разрешения. Анеуплоидия, триплоидия или значимый несбалансированный CNV в такой ситуации не объясняют произошедшую потерю. Это не равнозначно отсутствию генетической причины. Изменения отдельных нуклеотидов и небольшие варианты последовательности генов, экспансии повторов, CNV меньше установленного порога и часть других молекулярных нарушений остаются за пределами исследования. Нормальный ХМА также не устанавливает автоматически негенетическую причину потери. При повторном невынашивании дальнейшее обследование зависит от репродуктивного анамнеза и клинических данных. Анатомические нарушения матки, антифосфолипидный синдром, эндокринные заболевания и другие факторы оцениваются по самостоятельным диагностическим критериям; наличие нормального ХМА абортного материала само по себе ни один из этих механизмов не подтверждает. 

Соотношение с другими методами исследования абортного материала

Хромосомные нарушения отличаются по механизму, поэтому ни один метод не охватывает весь их спектр. Кариотипирование показывает число и структуру видимых хромосом, микроматричный анализ с высокой точностью определяет изменения количества генетического материала, а SNP-компонент дополнительно характеризует аллельный состав генома. Различия между исследованиями связаны с тем, какой тип генетического нарушения необходимо обнаружить.

Классическое кариотипирование

Классическое кариотипирование исследует хромосомы делящихся клеток. Оно позволяет определить анеуплоидии, полиплоидии и крупные структурные перестройки, а также увидеть сбалансированные транслокации и инверсии, при которых количество генетического материала не меняется. Для получения метафазных хромосом клетки абортного материала необходимо культивировать. Если культура не растёт, исследование выполнить невозможно; если преимущественно размножаются материнские клетки, результат способен ошибочно отражать кариотип женщины. Небольшие делеции и дупликации ниже разрешающей способности цитогенетического исследования также остаются незаметными.

SNP-хромосомный микроматричный анализ

ХМА исследует выделенную ДНК и не зависит от способности клеток к делению. Изменения количества генетического материала определяются по всему исследуемому геному, поэтому наряду с анеуплоидиями выявляются субмикроскопические делеции и дупликации в пределах разрешения конкретной платформы. SNP-генотипирование расширяет этот анализ за счёт аллельной информации. В исследованиях продуктов зачатия такая технология позволяет выявлять триплоидию, однородительскую дисомию и материнскую контаминацию. В рассматриваемой лабораторной услуге эти возможности конкретизированы: оцениваются триплоидия и полногеномная ОРД, определяется происхождение дополнительного генетического материала и контролируется материнская контаминация. Сбалансированная транслокация или инверсия не приводит к потере либо увеличению количества ДНК, поэтому непосредственно ХМА такую перестройку не выявляет. Если несбалансированный результат эмбриона вызывает подозрение на родительскую структурную перестройку, исследование дополняется кариотипированием родителей.

Исследование архивного материала

Когда свежий абортный материал не был сохранён генетическое исследование выполняется на фиксированной ткани или парафиновом блоке. Возможности такого анализа определяются сохранностью ДНК и используемой технологией. Поэтому результат архивного исследования нельзя автоматически считать эквивалентным полноценному SNP-ХМА свежего материала: состав выявляемых нарушений необходимо оценивать по характеристикам конкретной лабораторной услуги.

Ограничения метода

• ХМА не обнаруживает сбалансированные реципрокные и робертсоновские транслокации и инверсии, поскольку при этих перестройках общий объём генетического материала сохраняется. Данное ограничение относится к анализу самого абортного материала; сбалансированное носительство у родителей при соответствующих показаниях исследуется методом кариотипирования.
• Низкоуровневый мозаицизм также способен остаться невыявленным. Если аномальный хромосомный набор присутствует лишь в небольшой части клеток, суммарный сигнал микроматрицы приближается к нормальному. Для конкретной лабораторной услуги указано ограничение при доле мозаичного клона менее 25%, поэтому этот порог нельзя переносить на другие микроматричные платформы.
• Точковые варианты и небольшие изменения последовательности отдельных генов, экспансии тринуклеотидных повторов и большинство моногенных заболеваний данным исследованием не определяются. Нормальный ХМА поэтому исключает только те классы хромосомных нарушений, которые доступны используемой SNP-платформе, и не является доказательством отсутствия генетической причины потери беременности.