Хромосомный микроматричный анализ абортного материала

Потеря беременности остаётся одной из самых частых проблем в акушерской практике. По разным оценкам, от 10 до 20% клинически подтверждённых беременностей завершаются самопроизвольным прерыванием. Невынашивание беременности объединяет все формы потери до 22 недель гестации, включая самопроизвольный выкидыш и замершую беременность.
Наиболее частой причиной потерь беременности в первом триместре являются хромосомные аномалии, на их долю приходится от 50 до 60% потерь первого триместра и около 20–30% потерь второго триместра. Остальные случаи обусловлены негенетическими факторами. Среди наиболее значимых: анатомические аномалии матки (врождённые пороки развития, внутриматочные синехии, субмукозная миома), эндокринные нарушения (недостаточность лютеиновой фазы, гипотиреоз, некомпенсированный сахарный диабет), наследственные и приобретённые тромбофилии (антифосфолипидный синдром, мутации генов системы гемостаза), инфекционные и иммунологические причины. В значительной доле случаев этиология остаётся мультифакториальной или неустановленной.
Установление конкретной хромосомной причины позволяет объяснить произошедшее и оценить риск повторения, определить необходимость обследования родителей, а в ряде случаев выявить состояния, требующие активного наблюдения и лечения.
Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) представляет собой молекулярный метод исследования абортного материала, который анализирует ДНК плода, не требуя живых делящихся клеток. Это принципиально отличает его от классического кариотипирования, при котором необходимо вырастить клетки в культуре и остановить их деление на стадии метафазы для визуализации хромосом под микроскопом.
ХМА основан на технологии SNP-олигонуклеотидных микроматриц. Из абортного материала извлекается ДНК плода, которая наносится на микрочип (микроматрицу), содержащий около 1 миллиона молекулярных маркеров, каждый из которых соответствует определённому участку генома. По интенсивности связывания ДНК пациента с маркерами определяется количество генетического материала в каждой геномной области. Увеличение сигнала указывает на дупликацию (лишний материал), уменьшение – на делецию (утрату). После сканирования микроматрицы специализированное программное обеспечение сопоставляет полученные данные с референсными базами, что позволяет не только обнаружить отклонения, но и определить их точные геномные координаты и клиническую значимость.
Принципиальная особенность SNP-микроматриц состоит в том, что они анализируют не только копийность, но и генотип: для каждого участка генома определяется, какие варианты нуклеотидов (аллели) присутствуют и в каком соотношении. Именно это даёт методу уникальные возможности, недоступные другим платформам. По характеру распределения аллелей можно установить, унаследован ли генетический материал от обоих родителей или только от одного (однородительская дисомия), определить происхождение дополнительного хромосомного набора при триплоидии (отцовское или материнское), а также обнаружить присутствие материнских клеток в образце.

Что выявляет исследование и как интерпретировать результат

Диагностические возможности ХМА охватывают несколько уровней хромосомной патологии, от целых хромосом до субмикроскопических сегментов.

Числовые аномалии (анеуплоидии)  – наиболее частая категория хромосомных нарушений при невынашивании. Хромосомные аномалии в целом обнаруживаются в 50–60% спонтанных выкидышей первого триместра, и подавляющее большинство из них составляют именно анеуплоидии.  В клетке оказывается не 46 хромосом (как должно быть у человека), а на одну больше или на одну меньше. Основные варианты:

• Трисомия, при которой присутствуют три копии хромосомы вместо двух, общее число хромосом – 47. Самой частой причиной ранних выкидышей является трисомия 16-й хромосомы, несовместимая с жизнью. Трисомии 21, 18 и 13-й хромосом могут приводить как к потере беременности, так и к рождению детей с тяжёлыми синдромами.
• Моносомия, при которой утрачивается одна хромосома из пары, общее число хромосом равно 45. Моносомия X (кариотип 45,X) входит в число наиболее частых хромосомных причин невынашивания.

В большинстве случаев анеуплоидии возникают спонтанно и не связаны с наследственной патологией у родителей. Обнаружение анеуплоидии подтверждает хромосомную причину потери; прогноз для последующих беременностей, как правило, благоприятный, а риск повторения не превышает возраст-ассоциированный риск для матери. При трисомиях хромосом 13, 14, 15, 21 и 22 рекомендуется консультация генетика для исключения робертсоновской транслокации у одного из родителей, которая повышает вероятность трисомии у потомства.

Полиплоидии – это кратное увеличение полного хромосомного набора. Если при анеуплоидии изменяется число отдельных хромосом, то при полиплоидии удваивается или утраивается весь набор целиком. Основные варианты – триплоидия (три полных набора, 69 хромосом) и тетраплоидия (четыре набора, 92 хромосомы). Полиплоидии, как правило, несовместимы с жизнью и не связаны с наследственным риском у родителей. SNP-генотипирование позволяет определить родительское происхождение дополнительного набора, что имеет прямое клиническое значение.
Триплоидия обнаруживается примерно в 15–20% хромосомно-аномальных выкидышей первого триместра. Определение родительского происхождения дополнительного набора принципиально важно, поскольку два типа триплоидии ассоциированы с разными клиническими последствиями. Диандрическая триплоидия (дополнительный набор отцовского происхождения) возникает при оплодотворении нормальной яйцеклетки двумя сперматозоидами или одним с удвоением генома. В результате ткань, предназначенная для формирования плаценты (трофобласт), начинает бесконтрольно разрастаться, а эмбрион погибает на ранних сроках. Это состояние называется частичным пузырным заносом и ассоциировано с риском гестационной трофобластической болезни (ГТБ), что требует специфического наблюдения после прерывания беременности – мониторинга уровня ХГЧ для своевременного исключения злокачественной трофобластической неоплазии. Дигиническая триплоидия (дополнительный набор материнского происхождения) обычно приводит к задержке развития плода и ранней гибели без риска ГТБ. Это важное преимущество ХМА перед классическим кариотипированием, которое обнаруживает триплоидию, но не может установить происхождение дополнительного набора.
Отдельного надо отметить полный пузырный занос – состояние, при котором оплодотворяется «пустая» яйцеклетка, лишённая материнских хромосом. Весь генетический материал оказывается отцовского происхождения, эмбрион не формируется, а трофобласт разрастается бесконтрольно. ХМА выявляет это состояние по картине полногеномной отцовской однородительской дисомии. Как и частичный, полный пузырный занос требует мониторинга ХГЧ для исключения злокачественной трофобластической неоплазии.

Тетраплоидия (92 хромосомы) встречается значительно реже и, как правило, приводит к очень ранней гибели эмбриона.

Однородительская дисомия (ОРД) и участки отсутствия гетерозиготности.  В норме каждый человек получает одну копию каждой хромосомы от матери и одну от отца. Такая пара называется гомологичными хромосомами. В норме на гомологичных хромосомах в большинстве позиций присутствуют разные аллели (варианты гена), унаследованные от отца и матери, это состояние называется гетерозиготностью. SNP-генотипирование позволяет обнаружить участки хромосом, в которых нормальное чередование материнских и отцовских аллелей отсутствует. Такие участки обозначаются как LOH (loss of heterozygosity) или ROH (regions of homozygosity) и они могут возникать по двум принципиально разным причинам.

Первая – однородительская дисомия (ОРД), при которой обе копии хромосомы или её значительной части унаследованы от одного родителя. Общее количество генетического материала при этом не меняется, однако возникают две проблемы. Во-первых, нарушается активность импринтированных генов, функция которых зависит от того, от кого из родителей они получены. Во-вторых, рецессивные мутации, унаследованные от одного родителя, переходят в гомозиготное состояние и могут проявиться клинически.

Наибольшее клиническое значение имеет отцовская полногеномная ОРД, при которой все хромосомы получены только от отца. Она приводит к развитию полного пузырного заноса – аномальной беременности, при которой ткань плаценты (трофобласт) разрастается, а эмбрион отсутствует. Это связано с высоким риском гестационной трофобластической болезни (ГТБ) – опухолевого процесса, требующего специального наблюдения. Ни классическое кариотипирование, ни молекулярный скрининг копийности не способны выявить ОРД, поскольку общее количество хромосом остаётся нормальным. Это диагностическая возможность, уникальная для SNP-микроматриц.

ОРД отдельных хромосом связана с конкретными клиническими синдромами.

• Однородительская дисомия 15-й хромосомы материнского происхождения ассоциирована с синдромом Прадера–Вилли, отцовского – с синдромом Ангельмана
• Однородительская дисомия 11-й хромосомы отцовского происхождения может быть причиной синдрома Беквита–Видемана, характеризующегося избыточным ростом тканей
• Однородительская дисомия 7-й хромосомы материнского происхождения ассоциирована с синдромом Сильвера–Рассела, который характеризуется задержкой внутриутробного и постнатального роста, характерными чертами лица.

Вторая причина протяжённых участков гомозиготности – кровнородственный брак. Если родители состоят в кровном родстве, их геномы содержат значительную долю идентичных аллелей, унаследованных от общих предков. В этом случае SNP-микроматрица выявляет множественные участки LOH, распределённые по разным хромосомам. Такая картина указывает на повышенный риск аутосомно-рецессивных заболеваний у потомства и может стать основанием для углублённого генетического обследования пары.

Хромосомные делеции и дупликации.   Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) позволяет выявлять делеции (утраты) и дупликации (удвоения) фрагментов хромосом на двух принципиально различных уровнях.

Крупные перестройки (цитогенетический уровень) . ХМА надёжно детектирует делеции и дупликации, сопоставимые по размеру с теми, которые могут быть обнаружены при классическом кариотипировании. Однако в отличие от кариотипирования, микроматричный анализ не просто фиксирует наличие перестройки, но и точно определяет её границы – геномные координаты, что позволяет установить, какие именно гены затронуты.

• Делеции представляют собой утрату фрагмента хромосомы вместе с расположенными на нём генами. С клинической точки зрения потеря генетического материала, как правило, влечёт более тяжёлые последствия, чем его избыток, поскольку утрата даже одной копии гена (при неспособности оставшейся копии компенсировать функцию) приводит к гаплонедостаточности. Крупные делеции, затрагивающие десятки и сотни генов, как правило, сопровождаются множественными нарушениями развития. ХМА с высокой эффективностью выявляет как терминальные делеции (утрата концевого участка хромосомы), так и интерстициальные делеции (утрата фрагмента внутри хромосомы).
• Дупликации – это удвоение участка хромосомы, ведущее к избыточной дозе генов. Хотя клинические проявления дупликаций часто менее драматичны, чем при делециях сопоставимого размера, они также способны нарушать баланс генной экспрессии. Микроматричный анализ позволяет идентифицировать различные типы дупликаций: тандемные (удвоенный фрагмент располагается рядом с исходным) и инсерционные (удвоенный фрагмент встраивается в другой регион генома). Различение этих типов может иметь значение для оценки риска повторения перестройки у потомства.

Субмикроскопические перестройки (микроделеции и микродупликации) . Уникальная диагностическая зона ХМА – выявление перестроек, невидимых при стандартном кариотипировании, разрешающая способность которого ограничена 5–10 миллионами пар оснований (Мб). ХМА позволяет детектировать микроделеции и микродупликации размером от нескольких тысяч пар оснований до нескольких Мб. Часть таких субмикроскопических перестроек соответствует известным микроделеционным синдромам с установленной клинической картиной:

• 22q11.2 (синдром Ди Джорджи) – пороки сердца, иммунодефицит, гипокальциемия
• 7q11.23 (синдром Вильямса) – сердечно-сосудистая патология, характерный фенотип
• 5p15 (синдром кошачьего крика) – специфический плач, умственная отсталость
• 15q11-q13 – материнская делеция (синдром Ангельмана) vs отцовская делеция (синдром Прадера–Вилли)

Реципрокные микродупликации тех же регионов также имеют клиническое значение, хотя их фенотипические проявления более вариабельны: дупликация 22q11.2 ассоциирована с задержкой развития, дупликация 7q11.23 – с нарушениями речи и поведения, дупликации области 15q11-q13 – с расстройствами аутистического спектра и эпилепсией.

Диагностическое значение для семьи. Одновременное выявление терминальной микроделеции и микродупликации разных хромосом указывает на несбалансированную транслокацию у плода. Это служит основанием для кариотипирования обоих родителей: один из них с высокой вероятностью является носителем сбалансированной транслокации и, будучи клинически здоров, имеет повышенный риск образования несбалансированных гамет. Выявление носительства позволяет оценить репродуктивные риски и предложить паре ПГТ-СП при ЭКО или инвазивную пренатальную диагностику при последующих беременностях.

Контаминация материнскими клетками . Абортный материал неизбежно содержит ткани матери. При классическом кариотипировании, если в культуре выросли преимущественно материнские клетки, результат может оказаться ложнонормальным (46,XX), при этом выявить контаминацию стандартными цитогенетическими методами затруднительно. ХМА с SNP-генотипированием позволяет выявить примесь материнской ДНК по характеру распределения аллелей, что существенно снижает риск диагностической ошибки. Это важное практическое преимущество метода.

  Нормальный результат . Отсутствие выявленных аномалий означает, что в пределах разрешающей способности метода хромосомных нарушений не обнаружено. Диагностический поиск в таких случаях направляется в сторону негенетических причин невынашивания: анатомических, эндокринных, иммунологических, тромбофилических факторов. Нормальный результат ХМА не исключает моногенных мутаций, эпигенетических нарушений и патологии импринтинга, которые находятся за пределами возможностей метода и при наличии клинических показаний могут быть выявлены другими методами молекулярно-генетической диагностики.

Соотношение с другими методами исследования абортного материала

В лабораторном каталоге представлены три метода хромосомного анализа абортного материала, каждый из которых занимает определённую диагностическую нишу.

Классическое кариотипирование (GTG-бэндинг) остаётся единственным методом, позволяющим визуализировать хромосомы непосредственно. Оно выявляет сбалансированные перестройки (транслокации, инверсии), полиплоидии и мозаицизм. Его ограничение – необходимость живых клеток и невозможность обнаружения субмикроскопических изменений.

ХМА на свежем абортном материале работает с ДНК, не зависит от жизнеспособности клеток, обладает значительно более высоким разрешением для делеций и дупликаций и предоставляет уникальную информацию о генотипе (ОРД, тип триплоидии, контаминация). Существенным практическим преимуществом ХМА является скорость выполнения: результат, как правило, готов в течение 7–14 дней. Классическое кариотипирование требует предварительного культивирования клеток и занимает от двух до четырёх недель, а при медленном росте культуры – дольше. Основное ограничение ХМА – невозможность выявления сбалансированных перестроек.

Молекулярный скрининг хромосом на парафиновом блоке используется ретроспективно, когда свежий материал не был собран или утрачен. Он определяет копийность хромосом из архивной ткани, но, в отличие от ХМА, не обладает возможностями SNP-генотипирования.

При наличии свежего абортного материала выбор между кариотипированием и ХМА определяется клинической задачей. Если основной вопрос – исключение сбалансированной перестройки у плода (например, при известном носительстве у одного из родителей), предпочтительно классическое кариотипирование. Если необходим максимально широкий молекулярный анализ с определением генотипа и субмикроскопических перестроек, оптимальным выбором является ХМА.

Ограничения метода

ХМА не выявляет сбалансированные хромосомные перестройки (реципрокные и робертсоновские транслокации, инверсии), поскольку при них общее количество генетического материала не изменяется. Это принципиальное ограничение всех методов, основанных на анализе копийности и генотипа. Для выявления сбалансированных перестроек может потребоваться стандартное кариотипирование родителей.

Мозаицизм низкого уровня (доля аномального клеточного клона менее 20–25%) может остаться ниже порога чувствительности метода. Классическое кариотипирование, анализирующее каждую клетку отдельно, обладает в этом отношении большей чувствительностью.

Микроделеции и микродупликации, размер которых меньше порога разрешения используемой платформы, не детектируются. Точковые мутации, экспансия тринуклеотидных повторов, моногенные заболевания и эпигенетические нарушения находятся за пределами возможностей метода. При подозрении на моногенное заболевание необходимы другие методы молекулярно-генетической диагностики.

Исследование ограничено определением несбалансированных хромосомных аномалий и участков отсутствия гетерозиготности. При обнаружении патогенных изменений необходима консультация врача-генетика для клинической интерпретации результата и определения дальнейшей тактики.