Хромосомный анализ абортного материала, (кариотип плода)

Потеря беременности остаётся одной из самых частых проблем в акушерской практике. По разным оценкам, от 10 до 20% клинически подтверждённых беременностей завершаются самопроизвольным прерыванием. Истинная частота с учётом доклинических потерь ещё выше, поскольку значительная часть эмбрионов гибнет до того, как женщина узнаёт о беременности. Невынашивание беременности объединяет все формы потери до 22 недель гестации, включая самопроизвольный выкидыш и замершую беременность. Главной причиной являются хромосомные аномалии, на их долю приходится от 50 до 60% потерь первого триместра и около 20–30% потерь второго триместра. Остальные случаи обусловлены негенетическими факторами. Среди наиболее значимых: анатомические аномалии матки (врождённые пороки развития, внутриматочные синехии, субмукозная миома), эндокринные нарушения (недостаточность лютеиновой фазы, гипотиреоз, некомпенсированный сахарный диабет), наследственные и приобретённые тромбофилии (антифосфолипидный синдром, мутации генов системы гемостаза), инфекционные и иммунологические причины. В значительной доле случаев этиология остаётся мультифакториальной или неустановленной. Определение хромосомного набора погибшего эмбриона или плода позволяет ответить на центральный клинический вопрос: была ли потеря вызвана хромосомной аномалией или её причину следует искать среди перечисленных факторов.

Что представляет собой исследование

Классическое цитогенетическое исследование абортивного материала основано на анализе кариотипа – полного набора хромосом клетки. Визуализация хромосом возможна только в фазе  деления клетки, когда они находятся в максимально компактном состоянии (конденсированы) и доступны для морфологической оценки. В покоящейся (интерфазной) клетке генетический материал распределён по ядру в виде тонких нитей хроматина, и отдельные хромосомы неразличимы.
Для проведения исследования необходимы живые клетки плода, способные к делению. Из полученного абортного материала выделяют клетки плода, помещают их в питательную среду и выращивают в лабораторных условиях. Когда деление достигает нужной стадии (метафазы), его останавливают, хромосомы окрашивают специальным методом (GTG-бэндинг) и фотографируют.
Окрашивание создаёт на каждой хромосоме уникальный рисунок поперечных полос. Это своего рода штрихкод: у каждой из 23 пар хромосом он свой. По этому рисунку идентифицируется каждая хромосома, что позволяет выявить:

• общее число хромосом (диплоидный набор – 46)
• наличие анеуплоидий (трисомий, моносомий)
• половой хромосомный набор (XX или XY)
• структурные перестройки (транслокации, инверсии, делеции, дупликации)
• маркерные и добавочные хромосомы
• мозаичные варианты при достаточном числе анализируемых метафаз

В отличие от молекулярных методов, которые подсчитывают количество генетического материала, но не видят форму и структуру хромосом, данное исследование позволяет визуально проанализировать каждую хромосому в каждой отдельной клетке. Это особенно важно при диагностике наследственных форм репродуктивных потерь.
Результат записывается в стандартной международной номенклатуре ISCN. Нормальный мужской кариотип обозначается 46,XY, женский – 46,XX. Любое отклонение описывается стандартизированными символами: например, 47,XX,+21 означает женский кариотип с дополнительной 21-й хромосомой.

Что выявляет исследование и как интерпретировать результат

Классическое кариотипирование обладает наибольшим диагностическим охватом среди всех методов хромосомного анализа абортного материала. Исследование позволяет обнаруживать как количественные, так и крупные структурные нарушения хромосом с разрешающей способностью порядка 5–10 Мб.

Основные категории находок, их биологическая сущность и клиническое значение:

Числовые аномалии (анеуплоидии) – наиболее частая категория хромосомных нарушений при невынашивании. Хромосомные аномалии в целом обнаруживаются в 50–60% спонтанных выкидышей первого триместра, и подавляющее большинство из них составляют именно анеуплоидии.  В клетке оказывается не 46 хромосом (как должно быть у человека), а на одну больше или на одну меньше. Основные варианты:

• Трисомия, при которой присутствуют три копии хромосомы вместо двух, общее число хромосом – 47. Самой частой причиной ранних выкидышей является трисомия 16-й хромосомы, несовместимая с жизнью. Трисомии 21, 18 и 13-й хромосом могут приводить как к потере беременности, так и к рождению детей с тяжёлыми синдромами.
• Моносомия, при которой утрачивается одна хромосома из пары, общее число хромосом равно 45. Моносомия X (кариотип 45,X) входит в число наиболее частых хромосомных причин невынашивания.

В подавляющем большинстве случаев анеуплоидии возникают как случайная ошибка при формировании половых клеток или на ранних стадиях дробления зиготы. Они не связаны с наследственной патологией у родителей, а риск повторения в целом невысок, хотя увеличивается с возрастом матери. Обнаружение анеуплоидии подтверждает генетическую причину потери. При трисомиях хромосом 13, 14, 15, 21 и 22 генетик может рекомендовать кариотипирование обоих родителей для исключения робертсоновской транслокации, которая повышает вероятность трисомии у потомства.

Полиплоидии – это кратное увеличение полного хромосомного набора. Триплоидия (69 хромосом вместо 46) обнаруживается примерно в 15–20% хромосомно-аномальных выкидышей первого триместра. Она возникает при оплодотворении яйцеклетки двумя сперматозоидами или при нерасхождении всего набора хромосом в одной из половых клеток. Тетраплоидия (92 хромосомы) встречается реже и обычно связана с нарушением цитокинеза после оплодотворения. Полиплоидии всегда летальны и не связаны с наследственным риском у родителей. Их выявление является важным преимуществом классического кариотипирования: молекулярные методы, оценивающие количество генетического материала по каждой хромосоме, не способны распознать полиплоидию, поскольку при ней соотношение между хромосомами остаётся пропорциональным.

Структурные перестройки (аберрации) представляют собой изменения целостности хромосом, которые могут проявляться в виде транслокаций, инверсий, делеций, дупликаций или формирования маркерных хромосом. С клинической точки зрения принципиальное значение имеет разделение этих изменений на сбалансированные и несбалансированные формы, поскольку именно баланс генетического материала определяет прогноз для развития организма.
Несбалансированные перестройки характеризуются утратой (делеция) или избытком (дупликация) хромосомного материала. Подобный дисбаланс, как правило, нарушает тонкую регуляцию генов в период эмбриогенеза и в большинстве случаев оказывается несовместимым с нормальным развитием плода. Выявление несбалансированной перестройки у плода служит прямым показанием для кариотипирования обоих родителей. Такая необходимость продиктована тем, что выявленная потеря или удвоение материала нередко являются следствием наследования перестроенной хромосомы от фенотипически здорового родителя – носителя сбалансированной транслокации или инверсии.
У родителя-носителя количественный состав генетического материала остается полным, однако в процессе мейоза (созревания половых клеток) возникают аномальные варианты расхождения хромосом. Это приводит к формированию половых клеток с несбалансированным набором, что повышает риск повторных репродуктивных потерь или рождения ребенка с хромосомной патологией. В таких ситуациях паре могут быть предложены две стратегии профилактики:

• при использовании вспомогательных репродуктивных технологий – преимплантационное генетическое тестирование структурных перестроек (ПГТ-СП), позволяющее отобрать эмбрионы с нормальным кариотипом;
• при наступлении спонтанной беременности – инвазивная пренатальная диагностика (биопсия ворсин хориона или амниоцентез) для своевременного выявления возможного дисбаланса у плода.

Сбалансированные перестройки представляют собой взаимный обмен фрагментами между хромосомами без потери или удвоения генетического материала. Выявление такой перестройки у плода требует осторожной интерпретации. С одной стороны, она может быть унаследована от клинически здорового родителя и в этом случае не является причиной гибели эмбриона или пороков развития. С другой стороны, существует вероятность так называемого «эффекта разрыва гена» в точках разрыва хромосом либо наличие микродисбаланса, который остается неразличимым при стандартном цитогенетическом исследовании. Речь о субмикроскопических делециях или дупликациях в точках разрыва, которые слишком малы для разрешающей способности GTG-бэндинга, но могут быть обнаружены молекулярными методами.

Мозаицизм. Термин «мозаицизм» обозначает ситуацию, при которой в абортном материале присутствуют две или более клеточные линии с различными хромосомными наборами. Он возникает, когда ошибка происходит не в половой клетке родителя, а уже после зачатия, на одном из ранних делений зиготы. Если на раннем этапе эмбриогенеза в одной из клеток возникает сбой в расхождении хромосом, то все клетки-потомки этой линии будут наследовать аномальный набор. В результате формируется эмбрион, состоящий из двух (или более) генетически различных клонов клеток, часть которых несёт аномальный набор хромосом, а часть – нормальный. Кариотипирование обнаруживает мозаицизм благодаря тому, что анализируется множество отдельных клеток (стандартно не менее 20 метафаз): если среди них присутствуют клетки с разным кариотипом, это будет зафиксировано. Клиническое значение мозаицизма зависит от доли аномальных клеток и вовлечённой хромосомы. Молекулярные методы, работающие с усреднённым сигналом ДНК, могут пропустить мозаицизм низкого уровня (менее 20–30% аномальных клеток).

Нормальный кариотип – отдельный и клинически важный сценарий. Отсутствие хромосомных аномалий означает, что потеря беременности не связана с числовыми или структурными нарушениями хромосом. Диагностический поиск направляется в сторону негенетических факторов: анатомических особенностей матки, эндокринных нарушений, тромбофилий, иммунологических причин, инфекций. При интерпретации нормального результата необходимо учитывать два обстоятельства. Первое: при получении нормального женского кариотипа (46,XX) необходимо учитывать возможность преобладания материнских клеток в культуре (контаминация децидуальной тканью). Абортный материал неизбежно содержит ткани матери, и если в культуре выросли преимущественно материнские клетки, результат будет ложнонормальным. При нормальном кариотипе 46,XY такая ошибка исключена, поскольку Y-хромосома не может принадлежать матери. Второе: нормальный кариотип не исключает моногенных мутаций, субмикроскопических делеций и дупликаций, эпигенетических нарушений, патологии импринтинга. Все они находятся за пределами разрешающей способности метода.

Что происходит, если клетки не вырастают: переход на ХМА

Принципиальная особенность классического кариотипирования состоит в том, что для анализа необходимы живые, способные к делению клетки. Биоматериал должен быть доставлен в лабораторию в стерильной транспортной среде или физиологическом растворе, при контролируемой температуре и в кратчайшие сроки после получения. Однако даже при соблюдении всех правил преаналитики существует риск того, что клетки не начнут делиться в культуре. Причинами могут быть длительный интервал между гибелью плода и получением материала, бактериальная контаминация, механическое повреждение ткани, недостаточное количество жизнеспособных клеток. Частота неудачного культивирования, по данным разных лабораторий, составляет от 5 до 40%, причём наиболее высока она при замершей беременности с длительной задержкой экспульсии и при малом сроке гестации.

В случаях, когда рост клеток в культуре не получен, стандартный протокол исследования предусматривает замену метода: анализ выполняется с использованием хромосомного микроматричного анализа (ХМА). Принципиальное преимущество ХМА заключается в том, что он не требует присутствия живых делящихся клеток, так как метод основан на работе с ДНК, которая может быть выделена из любого биоматериала, включая ткань, утратившую признаки жизнеспособности. ХМА определяет копийность всех хромосом (число копий ДНК в каждой геномной области), выявляет числовые аномалии (трисомии, моносомии), а также субмикроскопические делеции и дупликации, невидимые при обычном кариотипировании.

Однако переход на ХМА имеет определённые ограничения:

• метод не выявляет сбалансированные хромосомные перестройки (транслокации, инверсии), поскольку при них общая копийность генетического материала остается неизменной
• в стандартном варианте анализа не детектирует полиплоидию (триплоидию и тетраплоидию)
• может не распознать мозаицизм низкого уровня (доля аномального клона менее 20–30% остается ниже порога чувствительности метода)

Таким образом, замена классического кариотипирования на ХМА при неудачном культивировании клеток позволяет получить диагностически значимый результат в ситуации, когда стандартное исследование технически невыполнимо. Однако такая замена неизбежно сужает спектр выявляемых хромосомных аномалий.

Соотношение с молекулярным скринингом хромосом

Классическое кариотипирование обладает максимальным диагностическим охватом: оно видит числовые аномалии, полиплоидии, структурные перестройки (включая сбалансированные) и мозаицизм. Его принципиальное ограничение – необходимость живых клеток. Молекулярный скрининг, напротив, работает с архивными парафиновыми блоками, не зависит от жизнеспособности клеток и практически не даёт неинформативных результатов. Его ограничения зеркальны: он не выявляет полиплоидии, сбалансированные перестройки и мозаицизм низкого уровня.
Оптимальная стратегия выглядит следующим образом. При наличии свежего абортного материала методом первого выбора является классическое кариотипирование: оно даёт максимум информации. Если культивирование не удалось, лаборатория переходит на ХМА, обеспечивая получение результата. Молекулярный скрининг парафиновых блоков используется ретроспективно, когда свежий материал не был собран или утрачен, а гистологический блок сохранился в архиве патологоанатомического отделения.

Ограничения метода

Основным ограничением является зависимость от жизнеспособности клеток. Если клетки абортного материала не начинают делиться в культуре, получение классического кариотипа невозможно, в этом случае лаборатория переходит на ХМА.
Вторым ограничением является разрешающая способность метода. GTG-бэндинг позволяет обнаружить перестройки размером от 5–10 миллионов пар оснований. Субмикроскопические делеции и дупликации (менее 5 Мб) остаются невидимыми. Для их выявления необходимы молекулярные методы (ХМА, MLPA).
Третье ограничение – риск контаминации материнскими клетками. Абортный материал неизбежно содержит клетки матери (децидуальная ткань, кровь). Если при подготовке образца материнские клетки не были тщательно отделены, они могут преобладать в культуре и дать ложный результат – нормальный женский кариотип 46,XX, принадлежащий не плоду, а матери. Результат 46,XY свободен от этой проблемы, поскольку Y-хромосома однозначно принадлежит плоду.
Еще одно ограничение связано с тем, что спектр выявляемых нарушений ограничен крупными хромосомными изменениями. Метод не позволяет диагностировать моногенные заболевания, точковые мутации, малые инсерции и делеции, эпигенетические дефекты и нарушения импринтинга, поэтому интерпретация результатов должна учитывать технические ограничения классического цитогенетического анализа и, при наличии клинических показаний, дополняться молекулярными методами исследования.