Свиной грипп (Influenza A/H1N1), качественное выявление РНК вируса методом ПЦР

Исследование выявляет вирус гриппа A субтипа H1N1 в мазке из верхних дыхательных путей. Тест определяет, вызвано ли заболевание именно этим субтипом гриппа. 
Методом ПЦР в мазке из ротоносоглотки определяется наличие или отсутствие РНК вируса гриппа A субтипа H1N1 (Influenza A/H1N1). Результат: «обнаружено» или «не обнаружено». Предел обнаружения тест-системы составляет 2000 копий/мл образца. Тест-система валидирована на штаммах A(H1N1)pdm09 различных эпидемических сезонов и не даёт перекрёстных реакций с вирусом гриппа B, респираторно-синцитиальным вирусом, SARS-CoV-2, метапневмовирусом, вирусами парагриппа, риновирусами, аденовирусами, коронавирусами и рядом бактериальных патогенов респираторного тракта. Максимальная информативность теста достигается при заборе материала в первые 3–5 дней от начала симптомов, когда вирусовыделение наиболее интенсивно. ПЦР существенно превосходит по чувствительности экспресс-тесты на антигены гриппа (быстрые иммунохроматографические тесты), чувствительность которых составляет лишь 50–70%, что приводит к значительной доле ложноотрицательных результатов, особенно у взрослых.

Грипп — острая респираторная вирусная инфекция, вызываемая РНК-содержащими вирусами семейства Orthomyxoviridae. Вирусы гриппа подразделяются на типы A, B и C; типы A и B ежегодно вызывают сезонные эпидемии. Вирус гриппа A классифицируется по двум поверхностным белкам: гемагглютинину (H), обеспечивающему прикрепление вируса к клеткам дыхательного эпителия, и нейраминидазе (N), позволяющей новообразованным вирусным частицам отделиться от инфицированной клетки и распространиться далее. Субтипы H1N1 и H3N2 являются основными циркулирующими штаммами среди людей. Геном вируса гриппа A состоит из восьми отдельных сегментов РНК, которые при одновременном заражении одной клетки несколькими вирусами способны «перетасовываться» — этот процесс называется реассортацией и является главным механизмом появления принципиально новых пандемических штаммов. Свиньи играют особую роль в эволюции вирусов гриппа, поскольку клетки их дыхательного эпителия несут рецепторы и к «птичьим», и к «человеческим» вариантам вируса, что делает их своеобразным «смесительным сосудом», в котором могут встретиться и обменяться генами вирусы различного происхождения.

Субтип A/H1N1pdm09 стал причиной первой пандемии XXI века. Первые случаи были зарегистрированы в марте 2009 года в Мексике, в апреле вирус был идентифицирован в Калифорнии (отсюда второе название — «калифорнийский штамм», A/California/04/2009). К июню 2009 года инфекция распространилась более чем в 70 странах, и ВОЗ объявила пандемию. По официальным данным, лабораторно подтверждённая инфекция стала причиной более 18 000 смертей; по экспертным оценкам, реальное число летальных исходов составило от 150 000 до 575 000. Пандемический штамм представлял собой результат реассортации генетических сегментов от четырёх предшественников: вирусов гриппа свиней Северной Америки, свиней Евразии, вирусов гриппа птиц и человека. После завершения пандемической фазы в 2010 году вирус A(H1N1)pdm09 не исчез — он продолжает циркулировать как один из возбудителей сезонного гриппа наряду с A(H3N2) и гриппом B.

В отличие от других сезонных вирусов гриппа, A/H1N1pdm09 способен связываться с рецепторами эпителия не только верхних, но и нижних дыхательных путей (альвеолярного эпителия), что определяет его склонность к развитию первичной вирусной пневмонии. Для этого субтипа характерно острейшее начало: высокая лихорадка (38–40 °C), выраженная интоксикация, озноб, интенсивная головная боль, миалгии, сухой кашель. Отличительной особенностью является частота желудочно-кишечных проявлений — тошнота, рвота, диарея наблюдаются у 25–30% пациентов, что нетипично для сезонного гриппа. У части пациентов заболевание быстро прогрессирует с развитием пневмонии, острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), нейротоксикоза, инфекционно-токсического шока и ДВС-синдрома. Базовое репродуктивное число (R₀) для A(H1N1)pdm09 составляет 1,4–1,6, что обеспечивает быстрое распространение в популяции.

Грипп передаётся воздушно-капельным путём (при кашле, чихании, разговоре) и контактным путём через загрязнённые поверхности. Вирус сохраняет жизнеспособность на твёрдых непористых поверхностях (металл, пластик) до 24–48 часов, на пористых (ткань, бумага) — несколько часов. Инкубационный период составляет 1–4 дня (чаще 2 дня). Заразность появляется примерно за сутки до симптомов и сохраняется 5–7 дней; у детей и лиц с ослабленным иммунитетом период вирусовыделения может достигать 10–14 дней. Группы повышенного риска тяжёлого течения: беременные женщины (особенно II–III триместры), дети младше 5 лет (особенно младше 2 лет), пожилые люди, пациенты с хроническими заболеваниями лёгких (бронхиальная астма, ХОБЛ), сердечно-сосудистой системы, сахарным диабетом, ожирением (ИМТ ≥40) и лица с ослабленным иммунитетом. При пандемии 2009 года наблюдалась непропорционально высокая частота тяжёлых случаев у молодых взрослых 20–50 лет; предполагается, что лица старше 60 лет обладали определённой перекрёстной защитой благодаря контакту с родственными штаммами H1N1, циркулировавшими до 1957 года.

Клиническое значение

Определение РНК вируса гриппа A/H1N1 методом ПЦР решает задачу этиологической верификации гриппа и идентификации субтипа возбудителя. Клинические проявления гриппа A/H1N1 неотличимы от гриппа A/H3N2, гриппа B и ряда других респираторных инфекций (COVID-19, РСВ-инфекция, парагрипп, аденовирусная инфекция). Лабораторное подтверждение этиологии позволяет обосновать назначение противовирусной терапии: при подтверждённом гриппе могут быть назначены ингибиторы нейраминидазы (осельтамивир) или ингибиторы кэп-зависимой эндонуклеазы (балоксавир марбоксил), наиболее эффективные при раннем начале — в первые 48 часов от появления симптомов. Подтверждение гриппа A/H1N1 на фоне одновременной циркуляции нескольких респираторных вирусов позволяет врачу выбрать целенаправленную терапию. Лицам из групп риска при подтверждённом контакте с больным гриппом A/H1N1 может быть показана постконтактная противовирусная профилактика.

Идентификация субтипа H1N1 имеет значение для оценки прогноза и определения тактики наблюдения. Субтип A/H1N1pdm09 ассоциирован с повышенным риском первичной вирусной пневмонии и ОРДС по сравнению с H3N2 и гриппом B, особенно у молодых взрослых, беременных и лиц с ожирением. Подтверждение этого субтипа у пациента из группы риска повышает настороженность в отношении осложнений и может определять решение о госпитализации, интенсивности мониторинга и начале противовирусной терапии даже при первоначально нетяжёлом течении. Субтипирование также имеет эпидемиологическое значение: данные о циркулирующих субтипах используются для оценки соответствия вакцинных штаммов и эпидемиологического надзора.

Исследование особенно востребовано у пациентов из групп повышенного риска тяжёлого течения: беременных женщин (грипп A/H1N1 ассоциирован с повышенным риском осложнений для матери и плода, включая преждевременные роды), детей раннего возраста, пожилых, пациентов с хроническими заболеваниями лёгких и сердца, а также у лиц с ослабленным иммунитетом (лица, живущие с ВИЧ-инфекцией, реципиенты трансплантатов, пациенты на химиотерапии или биологической иммуносупрессивной терапии). У иммунокомпрометированных пациентов грипп может протекать атипично — с затяжным вирусовыделением, стёртой клинической картиной или молниеносным развитием пневмонии. У тяжёлых и иммунокомпрометированных пациентов отрицательный результат ПЦР из верхних дыхательных путей при сохраняющемся клиническом подозрении не является абсолютным основанием для отказа от противовирусной терапии; в таких случаях рекомендуется повторное тестирование или исследование образцов из нижних дыхательных путей (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж).

В условиях одновременной циркуляции нескольких респираторных вирусов исследование на субтип H1N1 может выполняться как отдельный моноплексный тест или в составе мультиплексных респираторных панелей. При необходимости комплексной дифференциальной диагностики предпочтительны мультиплексные панели, одновременно определяющие несколько респираторных патогенов. Ежегодная вакцинация против гриппа остаётся наиболее эффективным методом профилактики; современные вакцины содержат антигены актуальных штаммов, включая A/H1N1pdm09.

Таким образом, определение РНК гриппа A/H1N1 методом ПЦР наиболее информативно в первые дни заболевания у пациентов с клиникой гриппа, особенно у лиц из групп риска тяжёлого течения, в эпидемический сезон и при необходимости субтипирования для эпидемиологического надзора. Для широкого скрининга респираторных инфекций предпочтительны мультиплексные панели.

Ограничения

Положительный результат подтверждает присутствие РНК вируса гриппа A субтипа H1N1 в исследованном образце, но не определяет тяжесть заболевания и не позволяет прогнозировать развитие осложнений. Тяжесть течения зависит от возраста, сопутствующих заболеваний, иммунного статуса и своевременности начала лечения. 
Отрицательный результат не исключает грипп. Ложноотрицательные результаты возможны при заборе материала на поздних сроках заболевания (после 5–7 дней от начала симптомов), при неадекватной технике забора мазка и при вирусной нагрузке ниже предела обнаружения тест-системы (2000 копий/мл). У тяжёлых и иммунокомпрометированных пациентов при сохраняющемся подозрении на грипп и отрицательном результате из верхних дыхательных путей рекомендуется рассмотреть исследование образцов из нижних дыхательных путей. 
Исследование не предоставляет данных о чувствительности вируса к противовирусным препаратам. При подозрении на резистентность необходимо специализированное исследование. Исследование определяет наличие вирусной РНК, но не оценивает жизнеспособность вируса. Повторная ПЦР для подтверждения прекращения вирусовыделения, как правило, не рекомендуется у иммунокомпетентных пациентов; решение о снятии изоляции основывается на клинических критериях и сроках от начала заболевания. 
Результат исследования требует интерпретации врачом с учётом клинической картины, эпидемиологической обстановки (циркулирующие субтипы в текущем сезоне), сроков от начала заболевания, вакцинального анамнеза и наличия факторов риска тяжёлого течения.