Свиной грипп (Influenza A/H1N1), качественное выявление РНК вируса методом ПЦР

Методом ПЦР в мазке из рото- и носоглотки определяют наличие или отсутствие РНК вируса гриппа A субтипа H1N1. Результат выдают в качественном формате: «обнаружено» или «не обнаружено». Предел обнаружения используемой лабораторией тест-системы составляет 2000 копий/мл образца. По данным лаборатории, тест-система валидирована на штаммах A(H1N1)pdm09 различных эпидемических сезонов. При аналитической проверке перекрёстные реакции с вирусом гриппа B, респираторно-синцитиальным вирусом, SARS-CoV-2, метапневмовирусом, вирусами парагриппа, риновирусами, аденовирусами, коронавирусами и рядом бактериальных патогенов респираторного тракта не выявлены. Вероятность выявления вирусной РНК наиболее высока при взятии материала в первые дни заболевания, ориентировочно в течение первых 3–5 дней, когда содержание вируса в верхних дыхательных путях обычно максимально. Молекулярные методы могут выявлять РНК вируса и позднее, особенно у детей, пациентов с тяжёлым течением и лиц с иммунодефицитом. ПЦР обладает более высокой диагностической чувствительностью, чем быстрые иммунохроматографические тесты на антигены гриппа, чувствительность которых часто составляет около 50–70%. Поэтому отрицательный результат экспресс-теста не исключает грипп.

Грипп представляет собой острую респираторную инфекцию, вызываемую РНК-содержащими вирусами семейства Orthomyxoviridae. Вирусы гриппа подразделяются на типы A, B, C и D; сезонные заболевания у человека преимущественно вызывают вирусы типов A и B. Вирус гриппа A классифицируют по поверхностным белкам гемагглютинину и нейраминидазе. Гемагглютинин участвует в прикреплении вируса к клеткам, а нейраминидаза способствует высвобождению вновь образованных вирусных частиц. В настоящее время среди людей регулярно циркулируют два субтипа вируса гриппа A: A(H1N1)pdm09 и A(H3N2).
Геном вируса гриппа A состоит из восьми сегментов РНК. При одновременном заражении одной клетки разными вирусами гриппа возможен обмен генетическими сегментами, называемый реассортацией. Этот механизм может приводить к появлению вирусов с новым сочетанием генов. Пандемический вирус A(H1N1)pdm09 имел сложное реассортантное происхождение и содержал генетические сегменты североамериканской и евразийской линий вирусов гриппа свиней, формирование которых ранее также было связано с вирусами птичьего и человеческого происхождения.

A(H1N1)pdm09 стал причиной пандемии гриппа 2009 года. Новый вирус был выявлен в Северной Америке весной 2009 года, а 11 июня Всемирная организация здравоохранения объявила о начале пандемии. По официальной регистрации лабораторно подтверждённые случаи включали более 18 000 летальных исходов, однако моделирование с учётом невыявленных случаев оценило число смертей во всём мире в первый год циркуляции вируса в диапазоне от 151 700 до 575 400. После завершения пандемической фазы вирус не исчез и продолжил циркулировать как возбудитель сезонного гриппа. Обозначение A/California/04/2009 относится к одному из ранних вирусных изолятов, а не является вторым названием всего субтипа. Инфекция A(H1N1)pdm09 может протекать с лихорадкой, ознобом, головной болью, миалгиями, выраженной слабостью, болью в горле и кашлем. Возможны тошнота, рвота и диарея, особенно у детей. При тяжёлом течении грипп может осложняться вирусной или вторичной бактериальной пневмонией, дыхательной недостаточностью и острым респираторным дистресс-синдромом. По клиническим проявлениям инфекцию A(H1N1) невозможно надёжно отличить от гриппа A(H3N2), гриппа B, COVID-19, РСВ-инфекции и других острых респираторных заболеваний.

Грипп распространяется главным образом с респираторными выделениями при кашле, чихании, разговоре и тесном контакте с заболевшим. Передача через загрязнённые руки и поверхности также возможна, но точная продолжительность сохранения жизнеспособного вируса зависит от условий окружающей среды. Инкубационный период обычно составляет 1–4 дня. Выделение вируса может начинаться до появления симптомов и сохраняться в течение нескольких дней после начала болезни; у детей и иммунокомпрометированных пациентов этот период может быть более продолжительным. К группам повышенного риска осложнений гриппа относятся беременные женщины, дети младше пяти лет, особенно младше двух лет, люди старшего возраста, пациенты с хроническими заболеваниями органов дыхания, сердечно-сосудистой системы и обмена веществ, лица с выраженным ожирением и иммунодефицитными состояниями. При подозрении на грипп пациентам из групп риска требуется своевременная клиническая оценка; решение о начале противовирусного лечения не должно откладываться до получения результата анализа.

Клиническое значение

Исследование помогает установить этиологию заболевания в случаях, когда клинические проявления не позволяют отличить грипп от COVID-19, РСВ-инфекции, парагриппа, аденовирусной инфекции и других респираторных заболеваний. Результат может учитываться при выборе лечебной тактики, проведении дополнительных исследований и назначении противоэпидемических мероприятий. Противовирусные препараты наиболее эффективны при раннем начале лечения, у госпитализированных пациентов, при тяжёлом или прогрессирующем заболевании и у лиц с высоким риском осложнений терапию при подозрении на грипп начинают на основании клинической оценки, не ожидая лабораторного подтверждения. Применяемые противогриппозные препараты действуют в отношении вирусов гриппа A и B и не являются специфичными исключительно для субтипа H1N1.

Идентификация H1N1 имеет прежде всего этиологическое и эпидемиологическое значение: субтипирование используют для наблюдения за циркуляцией вариантов вируса гриппа A, изучения их распространённости и формирования данных эпидемиологического надзора. Сам по себе положительный результат на H1N1 не определяет тяжесть заболевания, индивидуальный прогноз, необходимость госпитализации или интенсивность наблюдения. Молекулярное подтверждение гриппа особенно значимо у пациентов с высоким риском осложнений, при тяжёлом или прогрессирующем течении, необходимости госпитализации, а также при обследовании пациентов с иммунодефицитными состояниями. У иммунокомпрометированных лиц заболевание может сопровождаться длительным выделением вируса, нетипичной клинической картиной и быстрым развитием осложнений. При этом исследование только на H1N1 целесообразно, когда клиническая или эпидемиологическая задача требует определения именно данного субтипа. У госпитализированных пациентов с тяжёлым поражением нижних дыхательных путей отрицательный результат исследования материала из верхних дыхательных путей не исключает грипп. 

Моноплексный анализ на H1N1 не выявляет вирус гриппа A(H3N2), вирус гриппа B и другие возбудители респираторных инфекций. Если необходимо установить причину респираторного заболевания без предварительных данных о предполагаемом возбудителе, более информативным может быть исследование на грипп A и B либо мультиплексная респираторная панель, одновременно определяющая несколько вирусных и, в зависимости от состава, бактериальных патогенов.

Ограничения

Отрицательный результат означает, что РНК A(H1N1) в образце не обнаружена либо её количество находится ниже предела обнаружения тест-системы. Такой результат не исключает инфекцию A(H1N1), особенно при позднем или технически неадекватном заборе материала, нарушении условий транспортировки, низком содержании вируса в верхних дыхательных путях или преимущественном поражении нижних дыхательных путей. Отрицательный результат также не исключает грипп A(H3N2), грипп B и другие респираторные инфекции, поскольку исследование направлено только на субтип H1N1. Исследование выявляет вирусную РНК, но не определяет жизнеспособность вируса и его способность к передаче другому человеку. Результат интерпретируют с учётом симптомов, сроков от начала заболевания, качества и локализации взятого материала, эпидемиологической обстановки, сведений о циркулирующих вирусах, вакцинального анамнеза и факторов риска тяжёлого течения. Решение о лечении пациента с тяжёлым или прогрессирующим заболеванием либо высоким риском осложнений не должно основываться только на результате ПЦР.