ПЦР-диагностика гриппа: определение РНК вируса гриппа A подтипов H1N1 и H3N2 (свиной грипп, гонконгский грипп)

ПЦР-диагностика гриппа — молекулярно-биологическое исследование, которое выявляет РНК вируса гриппа A и определяет его подтип: H1N1 (A(H1N1)pdm09, так называемый «свиной грипп») или H3N2 (так называемый «гонконгский грипп»). Это два подтипа вируса гриппа A, которые с 2009 года имеют основную эпидемическую актуальность в человеческой популяции и ежегодно вызывают сезонные эпидемии наряду с вирусом гриппа B. Биоматериал — соскоб эпителиальных клеток слизистой оболочки носоглотки и ротоглотки. Результат: «обнаружено» или «не обнаружено» для каждого подтипа. Предел обнаружения — 2000 копий/мл образца. Специфичность тест-системы подтверждена на 17 штаммах H1N1pdm09 и H3N2 различных эпидемических сезонов; перекрёстных реакций с вирусом гриппа B, гриппом A(H7N9), коронавирусами (включая SARS-CoV-2 и MERS-CoV), РСВ, метапневмовирусом, парагриппом 1–4, риновирусом, аденовирусом, бокавирусом и основными бактериальными возбудителями респираторных инфекций не обнаружено.

Грипп — острая вирусная инфекция, передающаяся воздушно-капельным и контактно-бытовым путями. Возбудители — РНК-содержащие вирусы семейства Orthomyxoviridae. Вирусы гриппа A широко распространены в природе, их выделяют у большинства зверей и птиц, в связи с чем они обладают высоким пандемическим потенциалом благодаря способности преодолевать межвидовой барьер. Инкубационный период составляет от 1 до 4 дней (в среднем около 48 часов); больной заразен за сутки до появления симптомов и в течение 5–7 дней болезни. Типичный грипп характеризуется внезапным началом с ознобом, высокой лихорадкой (до 39–40°C), выраженной головной болью, ломотой в мышцах и суставах, сухим кашлем и общей прострацией. Через 2–3 дня острые симптомы проходят, хотя лихорадка может длиться до 5 дней, а кашель, слабость и утомляемость — сохраняться неделями. Большинство заболевших переносят грипп без осложнений, однако инфекция способна вызывать серьёзные осложнения (вирусная пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, миокардит, менингоэнцефалит, вторичные бактериальные инфекции), особенно у детей раннего возраста, пожилых, беременных, лиц с хроническими заболеваниями лёгких и сердца, метаболическими расстройствами и нарушениями иммунитета. При этом отличить грипп от других ОРВИ по клинической картине с уверенностью невозможно — лабораторное подтверждение необходимо для точной диагностики.

Подтипы H1N1 и H3N2 имеют ряд эпидемиологических и клинических различий. Вирус A(H1N1)pdm09 появился в 2009 году и вызвал первую пандемию гриппа XXI века; с тех пор циркулирует как сезонный штамм. Он способен связываться с рецепторами эпителия не только верхних, но и нижних дыхательных путей, что объясняет более частое развитие вирусной пневмонии. Для A(H1N1) характерно острейшее, нередко молниеносное начало с развитием выраженного токсикоза; тяжёлое течение чаще отмечается у молодых взрослых (18–64 лет), беременных женщин и лиц с ожирением. Среди клинических особенностей описаны более частые желудочно-кишечные симптомы, особенно у детей. Вирус A(H3N2) впервые вызвал пандемию в 1968 году в Гонконге; с тех пор не исчезал из циркуляции в человеческой популяции — на протяжении более полувека без его участия не обходилась ни одна сезонная эпидемия гриппа. H3N2 отличается высокой скоростью эволюции и, как правило, вызывает более тяжёлые эпидемии с большей избыточной смертностью, особенно среди пожилых людей старше 65 лет.

ПЦР с обратной транскрипцией — наиболее чувствительный и специфичный метод этиологической диагностики гриппа. Для максимальной информативности забор материала рекомендуется проводить как можно раньше от начала симптомов, в идеале — в первые 3–4 дня заболевания. Сроки детекции РНК вируса в верхних дыхательных путях вариабельны и зависят от времени забора, тяжести течения, иммунного статуса пациента и типа биоматериала; молекулярные тесты могут оставаться положительными и на более поздних сроках, однако чувствительность снижается по мере уменьшения выделения вируса.

Клиническое значение

Определение подтипа вируса гриппа A выходит за рамки простой констатации «грипп — да/нет» и предоставляет дополнительную информацию, которая влияет на терапевтические решения, эпидемиологический надзор и оценку прогноза.

Выбор противовирусной терапии — основная практическая задача субтипирования. Для лечения гриппа A применяются ингибиторы нейраминидазы (осельтамивир, занамивир) и ингибитор кэп-зависимой эндонуклеазы (балоксавир). Согласно клиническим рекомендациям МЗ РФ, осельтамивир является препаратом первой линии; назначение наиболее эффективно в первые 48 часов от начала симптомов. В актуальной практике оба циркулирующих подтипа — H1N1pdm09 и H3N2 — в целом сохраняют чувствительность к ингибиторам нейраминидазы и балоксавиру; адамантаны (амантадин, римантадин) не рекомендуются для обоих подтипов вследствие широко распространённой резистентности. Тем не менее профиль резистентности может меняться от сезона к сезону, и знание подтипа остаётся значимым для эпидемиологического мониторинга чувствительности, а также может учитываться врачом при выборе тактики в отдельных клинических ситуациях.

Эпидемиологический надзор и оценка прогноза неразрывно связаны с субтипированием. Мониторинг соотношения циркулирующих подтипов H1N1 и H3N2 необходим для оценки тяжести эпидемического сезона, соответствия вакцинного штамма циркулирующему вирусу и раннего выявления новых вариантов с изменённым антигенным профилем. На индивидуальном уровне подтип в сочетании с возрастом и сопутствующими заболеваниями помогает врачу оценить вероятность тяжёлого течения: при H1N1 повышенный риск у молодых взрослых, беременных и лиц с ожирением; при H3N2 — у пожилых старше 65 лет. Эта информация может влиять на решения о госпитализации, интенсивности наблюдения и тактике ведения. Субтипирование помогает уточнить этиологию в структуре респираторной инфекции и принять обоснованные решения об инфекционном контроле.

Ограничения

Исследование определяет только подтипы H1N1 и H3N2 вируса гриппа A. Грипп B не входит в состав теста — для его определения предназначены отдельные исследования или расширенные респираторные панели. Редкие подтипы гриппа A (H5N1, H7N9 и другие зоонозные варианты) данным тестом не идентифицируются. 
Исследование качественное — определяет наличие или отсутствие РНК подтипа, но не измеряет вирусную нагрузку. 
Отрицательный результат не исключает грипп. ПЦР наиболее информативна в первые 7 дней от начала заболевания; на поздних сроках (после 7–14-го дня) чувствительность снижается по мере уменьшения выделения вируса. Ложноотрицательные результаты возможны также при неадекватном заборе материала или при инфицировании вирусом гриппа B. При сохраняющемся клиническом подозрении на грипп и отрицательном результате рекомендуется расширить обследование. 
Нарушение правил подготовки к исследованию может повлиять на результат. 
Результат исследования требует интерпретации врачом с учётом клинической картины, эпидемиологической обстановки, возраста и сопутствующих заболеваний пациента.