ПЦР-диагностика гриппа: определение вируса гриппа А + В

Определение РНК вирусов гриппа A и B в отделяемом ротоносоглотки методом ПЦР — молекулярно-биологическое исследование, выявляющее генетический материал вирусов гриппа типов A и B в мазке или соскобе со слизистой оболочки носоглотки и ротоглотки. Грипп A и грипп B — РНК-содержащие вирусы семейства Orthomyxoviridae, ежегодно вызывающие сезонные эпидемии большей или меньшей интенсивности практически во всех странах мира. Вирус гриппа A широко распространён в природе, циркулирует среди людей и животных и обладает высоким пандемическим потенциалом благодаря способности к антигенному шифту (реассортации). Вирус гриппа B циркулирует преимущественно в человеческой популяции, не вызывает пандемий, но является возбудителем крупных вспышек и эпидемий, чаще поражая детей и подростков. Результат: «обнаружено» или «не обнаружено» для каждого типа.

Грипп — острая респираторная вирусная инфекция, передающаяся воздушно-капельным и контактно-бытовым путями. Инкубационный период составляет от 1 до 4 дней (в среднем около 48 часов); больной заразен за сутки до появления симптомов и в течение 5–7 дней болезни. Типичный грипп характеризуется внезапным началом с ознобом, высокой лихорадкой (до 39–40°C), выраженной головной болью, ломотой в мышцах и суставах, сухим кашлем и общей прострацией. Через 2–3 дня острые симптомы проходят, хотя лихорадка может длиться до 5 дней, а кашель, слабость и утомляемость — сохраняться неделями. Грипп занимает среди ОРВИ особое положение: он отличается более выраженной интоксикацией, более высоким риском осложнений (вирусная пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, миокардит, вторичные бактериальные инфекции) и более высокой летальностью. При этом отличить грипп от других ОРВИ по клинической картине с уверенностью невозможно — лабораторное подтверждение необходимо для точной диагностики.

Большинство заболевших переносят грипп без осложнений, однако инфекция способна вызывать серьёзные осложнения, особенно у детей раннего возраста, пожилых людей старше 65 лет, беременных женщин и в ранний послеродовый период, а также у лиц с хроническими заболеваниями лёгких, сердца, метаболическими расстройствами и нарушениями иммунитета.

ПЦР является наиболее чувствительным и специфичным методом этиологической диагностики гриппа, значительно превосходящим экспресс-тесты на основе иммунохроматографии и иммунофлуоресценции. Серологические методы (определение антител к вирусам гриппа в сыворотке крови) оцениваются ретроспективно и, как правило, не влияют на коррекцию терапии, хотя применимы для эпидемиологического надзора. Для максимальной информативности забор материала рекомендуется проводить как можно раньше от начала симптомов, в идеале — в первые 3–4 дня заболевания. Сроки детекции РНК вируса в верхних дыхательных путях вариабельны и зависят от времени забора, тяжести течения, иммунного статуса пациента и типа биоматериала; на поздних сроках чувствительность снижается по мере уменьшения выделения вируса.

Клиническое значение

Определение РНК вирусов гриппа A и B методом ПЦР применяется для подтверждения или исключения гриппа, дифференциальной диагностики с другими ОРВИ и обоснования противовирусной терапии. Грипп — единственная среди распространённых ОРВИ инфекция, для которой существуют эффективные противовирусные препараты: ингибиторы нейраминидазы (осельтамивир, занамивир) и ингибитор кэп-зависимой эндонуклеазы (балоксавир). Назначение наиболее эффективно в первые 48 часов от начала симптомов, что делает быструю лабораторную диагностику критически значимой. Согласно клиническим рекомендациям МЗ РФ, осельтамивир является препаратом первой линии для лечения гриппа. Лабораторное подтверждение гриппа обосновывает назначение противовирусной терапии, особенно у пациентов групп риска (дети до 5 лет, взрослые старше 65 лет, беременные, лица с хроническими заболеваниями), и позволяет избежать необоснованного назначения противогриппозных препаратов при других ОРВИ. У пациентов с нетяжёлым течением ОРВИ, не относящихся к группам высокого риска, отрицательный результат на грипп позволяет воздержаться от назначения противогриппозных препаратов. Однако у госпитализированных пациентов, при тяжёлом или прогрессирующем течении и у лиц из групп высокого риска противовирусное лечение должно начинаться как можно раньше и не должно откладываться из-за ожидания результата теста; отрицательный результат ПЦР снижает вероятность диагноза, но при сохраняющемся клиническом подозрении на грипп не является основанием для автоматического прекращения терапии.

Подтверждение вирусной этиологии заболевания — будь то грипп A или B — даёт основание воздержаться от антибактериальной терапии, которая при вирусных инфекциях неэффективна, но несёт риск побочных эффектов и формирования антибиотикорезистентности. Дифференциация типов A и B клинически значима: вирус гриппа A, как правило, вызывает более тяжёлые эпидемии с большей смертностью; адамантаны (амантадин, римантадин) могут рассматриваться только при гриппе A (хотя в настоящее время не рекомендуются вследствие широко распространённой резистентности), тогда как при гриппе B они заведомо неэффективны. Определение типа вируса также важно для эпидемиологического надзора: мониторинг соотношения циркулирующих типов A и B необходим для оценки тяжести эпидемического сезона, соответствия вакцинного состава циркулирующим штаммам и раннего выявления необычных эпидемиологических ситуаций.

Выявление гриппа у госпитализированного пациента обосновывает решения об инфекционном контроле: изоляция больного, применение капельных мер предосторожности, наблюдение за контактными. Исследование также применяется для мониторинга беременных с подозрением на грипп (тяжёлое течение гриппа у беременных ассоциировано с повышенным риском осложнений) и для обследования пациентов с тяжёлой внебольничной пневмонией, когда грипп рассматривается как возможная причина.

Таким образом, ПЦР на грипп A и B наиболее информативна в первые дни заболевания для обоснования назначения или отказа от противовирусной терапии, у пациентов групп риска тяжёлого течения, при госпитализации с тяжёлой респираторной инфекцией, для инфекционного контроля в стационаре и для эпидемиологического надзора. Данный тест не проводит субтипирование гриппа A (H1N1, H3N2) — для этого предназначено отдельное исследование.

Ограничения

Отрицательный результат не исключает грипп. Чувствительность ПЦР максимальна в первые 3–4 дня от начала симптомов; на поздних сроках выделение вируса снижается, и результат может быть ложноотрицательным. Ложноотрицательные результаты возможны также при неадекватном заборе материала. При сохраняющемся клиническом подозрении на грипп и отрицательном результате может потребоваться повторное исследование или обследование из дополнительных биоматериалов. 
Тест определяет вирусы гриппа A и B, но не проводит субтипирование гриппа A. Подтипы H1N1 и H3N2 данным исследованием не дифференцируются — для субтипирования предназначен отдельный тест. 
Тест не выявляет другие возбудители ОРВИ (РСВ, парагрипп, риновирус, метапневмовирус, коронавирусы, аденовирус, бокавирус). При необходимости комплексной оценки рекомендуются мультиплексные респираторные панели. 
Исследование определяет наличие или отсутствие РНК, но не измеряет вирусную нагрузку. 
Нарушение правил подготовки к исследованию может повлиять на результат. 
Результат исследования требует интерпретации врачом с учётом клинической картины, эпидемиологической обстановки, возраста, сопутствующих заболеваний и вакцинального статуса пациента.