ПЦР-диагностика клеща на выявление клещевого энцефалита

Исследование выявляет РНК вируса клещевого энцефалита в снятом клеще. Результат позволяет оценить, был ли клещ инфицирован возбудителем. 
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обнаруживает генетический материал вируса — рибонуклеиновую кислоту (РНК) — непосредственно в гомогенате тела клеща. Исследуемым материалом является целый клещ или его фрагменты, доставленные в лабораторию после извлечения из кожи пострадавшего. Результат выдаётся в формате «обнаружено / не обнаружено». Обнаружение РНК свидетельствует о присутствии вируса в переносчике, но не является прямым доказательством заражения укушенного человека. ПЦР принципиально отличается от серологических методов (ИФА, РТГА), которые применяются для диагностики инфекции у человека: анализ клеща даёт информацию о самом переносчике и используется для определения дальнейшей тактики наблюдения за пациентом ещё до появления клинических симптомов.

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) принадлежит к семейству Flaviviridae , роду Flavivirus . Выделяют три основных подтипа возбудителя: европейский, сибирский и дальневосточный, различающихся по географическому распространению, тяжести вызываемого заболевания и склонности к хроническому течению. Дальневосточный подтип ассоциирован с наиболее тяжёлыми формами болезни и высокой летальностью, тогда как европейский подтип чаще вызывает двухфазное течение с относительно благоприятным прогнозом. Основной путь передачи ВКЭ человеку — трансмиссивный, через присасывание инфицированного иксодового клеща (преимущественно Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus ). Значительно реже заражение происходит алиментарным путём при употреблении сырого молока коз и коров из эндемичных регионов.

Вирус проникает в организм человека со слюной клеща уже в первые минуты кровососания. Инкубационный период составляет в среднем от 7 до 14 суток, хотя возможны колебания от 2 до 28 дней. Первичная инфекция проявляется внезапным подъёмом температуры тела, интенсивной головной болью, миалгиями и общей слабостью. При европейском подтипе нередко наблюдается характерное двухволновое течение: после первой лихорадочной фазы наступает период мнимого благополучия, за которым следует вторая волна с поражением центральной нервной системы. Неврологические формы включают менингит, менингоэнцефалит и менингоэнцефаломиелит с развитием парезов и параличей.

Клещевой энцефалит остаётся значимой природноочаговой инфекцией на территории Российской Федерации: ежегодно регистрируется несколько тысяч случаев заболевания, а доля инфицированных клещей в эндемичных районах может достигать нескольких процентов от общей популяции переносчиков. Территории повышенного риска определяются Роспотребнадзором и ежегодно публикуются в виде перечня эндемичных районов.

Клиническое значение

Исследование клеща методом ПЦР на наличие РНК вируса клещевого энцефалита решает ключевую задачу: оно позволяет определить, нёс ли конкретный переносчик возбудитель, ещё до появления каких-либо симптомов у пострадавшего. Этот временной запас имеет прямое клиническое значение, поскольку при положительном результате врач может рассмотреть вопрос экстренной серопрофилактики — введения специфического иммуноглобулина против клещевого энцефалита. Согласно действующим рекомендациям, введение иммуноглобулина целесообразно не позднее 96 часов (4 суток) после присасывания клеща. Таким образом, быстрое получение результата исследования клеща может непосредственно определять дальнейшую клиническую тактику в отношении непривитого пациента.

Присасывание клеща является поводом для дифференциальной оценки рисков нескольких трансмиссивных инфекций одновременно. Один клещ может быть одновременно инфицирован вирусом клещевого энцефалита и другими патогенами: Borrelia burgdorferi sensu lato (возбудитель иксодового клещевого боррелиоза, или болезни Лайма), Anaplasma phagocytophilum (гранулоцитарный анаплазмоз человека), Ehrlichia chaffeensis и Ehrlichia muris (эрлихиоз). ПЦР-исследование клеща на ВКЭ позволяет разграничить ситуации, требующие различных профилактических подходов: при обнаружении только боррелий решается вопрос о назначении антибактериальной профилактики, тогда как выявление вируса клещевого энцефалита ставит вопрос о специфической серопрофилактике. При сочетанной заражённости клеща тактика комбинируется. Именно поэтому комплексное исследование клеща на несколько возбудителей одновременно является наиболее информативным подходом.

Особое значение определение РНК вируса клещевого энцефалита в клеще приобретает для пациентов с иммунодефицитными состояниями. У лиц, живущих с ВИЧ-инфекцией, реципиентов трансплантатов, пациентов, получающих химиотерапию или биологические иммуносупрессивные препараты, клиническое течение клещевого энцефалита может существенно отличаться от классической картины: симптоматика бывает стёртой или, напротив, молниеносной с быстрым развитием тяжёлых неврологических осложнений. У этой категории пациентов эффективность экстренной серопрофилактики иммуноглобулином может быть снижена, что делает информацию об инфицированности клеща ещё более важной для планирования динамического наблюдения и раннего начала симптоматической терапии при появлении первых признаков заболевания.

Для детей, особенно раннего возраста, результат исследования клеща также имеет существенное клиническое значение. Дети относятся к группе риска по тяжёлому течению клещевого энцефалита, а диагностика у них затруднена неспецифичностью начальных симптомов — лихорадки, вялости, отказа от еды, которые могут быть ошибочно расценены как проявления других инфекционных заболеваний. Раннее знание о том, что клещ содержал вирус, позволяет врачу обоснованно выстроить план наблюдения с акцентом на неврологический мониторинг.

Результат ПЦР-исследования клеща следует рассматривать в контексте вакцинального статуса пострадавшего. У лиц, прошедших полный курс вакцинации против клещевого энцефалита и получающих своевременные ревакцинации, положительный результат анализа клеща не является показанием для экстренного введения иммуноглобулина, однако может потребовать наблюдения. У непривитых и неполностью привитых пациентов положительный результат требует безотлагательного обращения к врачу для решения вопроса о серопрофилактике. Параллельно с исследованием клеща рекомендуется лабораторное наблюдение за пострадавшим: через 2 недели после присасывания — исследование крови на антитела классов IgM и IgG к вирусу клещевого энцефалита методом ИФА, а при появлении лихорадки — исследование крови пациента методом ПЦР.

Исследование наиболее информативно при доставке целого, неповреждённого клеща в ближайшие сроки после извлечения. Если клещ не сохранён, утрачен или доставлен в нежизнеспособном и сильно повреждённом состоянии, основным инструментом диагностики становится серологическое обследование пациента в динамике. Для лиц, находившихся на эндемичной территории и обнаруживших след от присасывания без самого клеща, целесообразно серологическое мониторирование в установленные сроки.

Ограничения метода

Положительный результат ПЦР-исследования клеща подтверждает наличие РНК вируса клещевого энцефалита в переносчике, однако не является доказательством инфицирования укушенного человека: не каждое присасывание заражённого клеща приводит к передаче вируса. Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии выявляемой РНК вируса в исследованном материале, но не исключает возможности заражения другими патогенами, переносимыми клещами, поэтому целесообразно параллельное тестирование на боррелии и другие возбудители. Результат характеризует только конкретный исследованный экземпляр клеща; при множественных присасываниях каждый клещ должен быть исследован отдельно. Степень сохранности клеща влияет на качество выделения нуклеиновых кислот: сильно повреждённые, высохшие или длительно хранившиеся при комнатной температуре экземпляры могут дать ложноотрицательный результат вследствие деградации РНК. Исследование не определяет подтип вируса клещевого энцефалита, и результат не позволяет прогнозировать тяжесть потенциального заболевания. Исследование клеща не заменяет лабораторного обследования самого пациента и не может использоваться как единственное основание для назначения или отмены профилактических мероприятий. Результат исследования требует интерпретации врачом с учётом времени, прошедшего с момента присасывания, вакцинального статуса пострадавшего, наличия иммунодефицитных состояний, эпидемиологической обстановки в регионе и клинических данных.