ПЦР-диагностика ротавируса серогруппы A, норовируса 1 и 2 типа, астровируса в кале

Исследование одновременно выявляет три основных вирусных возбудителя острого гастроэнтерита в кале. Один анализ проверяет наличие ротавируса, норовируса и астровируса. 
Методом ПЦР в образце кала определяется наличие или отсутствие РНК трёх вирусных возбудителей: ротавируса серогруппы A, норовируса геногрупп I и II, астровируса. Результат по каждому возбудителю выдаётся отдельно: «обнаружено» или «не обнаружено». Аналитическая чувствительность для всех позиций панели составляет 4×10³ копий РНК в мл исходного образца. Для максимальной информативности забор кала рекомендуется проводить в первые 72 часа от начала заболевания. ПЦР существенно превосходит по чувствительности иммунохроматографические экспресс-тесты и иммуноферментный анализ (ИФА), которые традиционно применялись для диагностики вирусных гастроэнтеритов. Для норовируса ПЦР является золотым стандартом диагностики, поскольку иммунологические тесты обладают генотип-зависимой чувствительностью и не всегда выявляют новые штаммы.

Все три возбудителя панели — безоболочечные РНК-содержащие вирусы, принадлежащие к разным семействам. Ротавирус серогруппы A (семейство Reoviridae) — ведущая причина тяжёлого гастроэнтерита у детей до 5 лет во всём мире. До внедрения вакцинации ротавирус обусловливал 20–60% госпитализаций по поводу диареи у детей; после введения ротавирусных вакцин в национальные календари многих стран заболеваемость значительно снизилась, однако вирус продолжает циркулировать. Наиболее тяжёлым течением характеризуется первый эпизод инфицирования; при повторных встречах с возбудителем тяжесть снижается, и увеличивается доля субклинических форм. Ротавирусная инфекция проявляется обильной водянистой диареей, многократной рвотой и лихорадкой; длительность заболевания составляет 5–8 дней, а при остром течении вирусные частицы выделяются с калом в очень больших количествах.

Норовирус (семейство Caliciviridae) — наиболее частая причина вирусного гастроэнтерита во всех возрастных группах и ведущий возбудитель вспышек в организованных коллективах (стационары, дома престарелых, круизные суда, детские учреждения). Геногруппы GI и GII охватывают подавляющее большинство штаммов, патогенных для человека; GII значительно преобладает. Норовирус отличается чрезвычайно низкой инфицирующей дозой (менее 10–18 вирусных частиц достаточно для заражения), высокой устойчивостью во внешней среде (устойчив к спиртовым антисептикам; для дезинфекции рекомендуются хлорсодержащие растворы в рабочих концентрациях) и способностью вызывать повторные заболевания, поскольку иммунитет непродолжителен и типоспецифичен. Наиболее часто реализуется контактно-бытовой путь передачи; норовирус дополнительно способен передаваться воздушно-капельным путём при рвоте, что объясняет его исключительный потенциал вызывать вспышки. Наиболее активное выделение наблюдается в первые 72 часа от начала заболевания; средняя продолжительность выделения с калом — около 14 дней, у детей дошкольного возраста и пожилых — в 1,5–2 раза дольше. У пациентов с ослабленным иммунитетом норовирус может вызывать хроническую инфекцию с длительной диареей и продолжительным вирусовыделением на протяжении месяцев.

Астровирус (семейство Astroviridae) вызывает гастроэнтерит преимущественно у детей раннего возраста и пожилых людей. Заболевание протекает, как правило, легче ротавирусной инфекции, с продолжительностью клинических проявлений 2–3 дня. Повышенная частота астровирусной инфекции отмечается у лиц с ослабленным иммунитетом. Все три возбудителя передаются фекально-оральным путём (через загрязнённые руки, воду, пищу, предметы обихода). Бессимптомное выделение вируса с калом документировано для всех трёх патогенов и может продолжаться несколько недель после клинического выздоровления.

Вирусный гастроэнтерит клинически проявляется острым началом водянистой (не кровянистой, не слизистой) диареи, тошнотой, рвотой, схваткообразными болями в животе и недомоганием; лихорадка менее характерна, чем при бактериальных инфекциях. У большинства иммунокомпетентных пациентов заболевание разрешается самостоятельно в течение нескольких дней, однако у детей раннего возраста, пожилых и лиц с ослабленным иммунитетом может приводить к тяжёлой дегидратации, требующей госпитализации.

Клиническое значение

Мультиплексная ПЦР вирусных возбудителей кишечных инфекций решает несколько клинических задач: устанавливает вирусную этиологию острого гастроэнтерита, идентифицирует конкретный возбудитель, выявляет коинфекции и позволяет дифференцировать вирусную диарею от бактериальной. Подтверждение вирусной этиологии позволяет обоснованно воздержаться от антибактериальной терапии, которая при вирусных гастроэнтеритах неэффективна, и сосредоточиться на регидратации и симптоматическом лечении. Это особенно важно у детей раннего возраста, госпитализированных с острой диареей, когда вопрос о назначении антибиотиков стоит наиболее остро, а необоснованное их применение несёт риск побочных эффектов и формирования антибиотикорезистентности. Отрицательный результат по всем трём вирусным возбудителям при сохраняющейся клинике гастроэнтерита направляет диагностический поиск в сторону бактериальных (сальмонеллы, шигеллы, кампилобактер, патогенные эшерихии) и паразитарных (лямблии, криптоспоридии) причин.

Идентификация конкретного вируса клинически значима и за пределами выбора терапии. Ротавирусная инфекция у детей первых лет жизни, как правило, протекает тяжелее норовирусной и астровирусной, с более выраженной дегидратацией — знание этиологии помогает врачу прогнозировать течение и интенсивность необходимой регидратационной поддержки. Обнаружение норовируса у госпитализированного пациента требует немедленных противоэпидемических мероприятий для предотвращения внутрибольничной вспышки: усиленного контактно-бытового режима, тщательной обработки поверхностей хлорсодержащими средствами, наблюдения за контактными. Выявление коинфекций (одновременное обнаружение двух и более вирусов) — дополнительное преимущество мультиплексного подхода; коинфекции могут быть ассоциированы с более тяжёлым или затяжным течением у детей раннего возраста.

Исследование особенно востребовано при острой диарее у детей раннего возраста и пожилых (группы риска тяжёлой дегидратации), при госпитализации для обоснования отказа от антибиотиков и при расследовании вспышек гастроэнтерита в организованных коллективах (стационары, детские учреждения, дома престарелых, предприятия общественного питания), когда необходимо быстро установить возбудитель и определить источник инфекции. У пациентов с ослабленным иммунитетом (лица, живущие с ВИЧ-инфекцией, реципиенты трансплантатов, пациенты на химиотерапии или биологической иммуносупрессивной терапии) все три вируса способны вызывать хроническую инфекцию с персистирующей диареей на протяжении недель и месяцев; клиническая диагностика в этой группе ненадёжна, поскольку диарея может быть единственным симптомом на фоне множества других причин кишечной дисфункции, а астровирусная инфекция встречается с повышенной частотой. ПЦР становится основным инструментом этиологической верификации у иммунокомпрометированных пациентов.

Панель не включает ряд других возбудителей кишечных инфекций — бактериальных (Salmonella, Shigella, Campylobacter, Clostridium difficile), вирусных (аденовирус F, саповирус) и паразитарных (лямблии, криптоспоридии). При отрицательном результате по всем позициям и сохраняющейся симптоматике рекомендуется расширенное обследование, включая бактериологический посев и, при необходимости, паразитологическое исследование. При затяжной диарее у иммунокомпрометированных пациентов повторное тестирование может использоваться для мониторинга элиминации возбудителя, хотя следует учитывать возможность длительного вирусовыделения без активной репликации.

Таким образом, мультиплексная ПЦР кала на ротавирус A, норовирус GI и GII, астровирус наиболее информативна при острых гастроэнтеритах у детей раннего возраста и пожилых, при госпитализации для обоснования отказа от антибиотиков, при расследовании вспышек и при хронической диарее у пациентов с иммунодефицитом. Специфической противовирусной терапии кишечных вирусов не существует; основой лечения остаётся регидратация.

Ограничения

Положительный результат подтверждает присутствие вирусной РНК в кале, но не во всех случаях означает, что обнаруженный вирус является причиной текущих симптомов. Бессимптомное вирусовыделение документировано для всех трёх патогенов: РНК норовируса выявляется методом ПЦР в стуле до 16% здоровых лиц. Выделение вируса с калом может продолжаться после клинического выздоровления — около 14 дней для норовируса (у детей и пожилых дольше), несколько дней для ротавируса и астровируса — поэтому положительный результат не всегда свидетельствует об острой фазе заболевания. Клиническая оценка необходима для определения этиологической значимости находки. 
Панель включает три наиболее частых вирусных возбудителя, но не охватывает аденовирус группы F (серотипы 40/41), саповирус и другие менее распространённые агенты вирусного гастроэнтерита. Бактериальные и паразитарные возбудители данной панелью не определяются. Отрицательный результат по всем позициям не исключает инфекционный гастроэнтерит. 
Максимальная информативность ПЦР достигается при заборе материала в первые 72 часа от начала заболевания. На более поздних сроках чувствительность может снижаться по мере уменьшения выделения вируса. Приём энтеросорбентов и антидиарейных препаратов может повлиять на качество биоматериала и достоверность результата. Нарушение правил подготовки к исследованию и сбора биоматериала также может повлиять на результат. 
Исследование определяет наличие или отсутствие РНК, но не измеряет вирусную нагрузку. Обнаружение вирусной РНК методом ПЦР не тождественно выявлению жизнеспособного вируса. Исследование не предназначено для контроля излеченности; повторная ПЦР кала после клинического выздоровления не рекомендуется в рутинной практике.