ПЦР-диагностика ротавируса серогруппы A, норовируса 1 и 2 типа, астровируса, энтеровируса в кале

Определение РНК кишечных вирусов в кале методом ПЦР — мультиплексное молекулярно-биологическое исследование, которое одновременно выявляет генетический материал трёх основных возбудителей вирусного гастроэнтерита — ротавируса серогруппы A, норовируса геногрупп I и II, астровируса — а также энтеровирусов, которые включены в панель как клинически значимые патогены, обнаруживаемые в кале при ряде системных инфекций. Исследование выполняется в образце кала. Результат по каждому возбудителю выдаётся отдельно: «обнаружено» или «не обнаружено». Для максимальной информативности забор кала рекомендуется проводить в первые 72 часа от начала заболевания. Панель позволяет в одном исследовании определить или исключить наиболее частые вирусные причины острой диареи, а также выявить энтеровирусы, обнаружение которых в кале может иметь значение при диагностике системных энтеровирусных инфекций.

Вирусный гастроэнтерит остаётся одной из ведущих инфекционных проблем мирового здравоохранения. Ежегодно регистрируется около 2 миллиардов эпизодов острой диареи, и вирусы являются ведущей причиной инфекционного гастроэнтерита, особенно у детей раннего возраста. Клинически вирусные гастроэнтериты проявляются острым началом водянистой (не кровянистой, не слизистой) диареи, тошнотой, рвотой, схваткообразными болями в животе и недомоганием; лихорадка менее характерна, чем при бактериальных инфекциях. Отличить различные вирусные гастроэнтериты друг от друга, а также отличить вирусную диарею от бактериальной по клинической картине невозможно — для этого необходимо лабораторное исследование. У большинства иммунокомпетентных пациентов заболевание протекает самоограниченно и разрешается в течение нескольких дней, однако у детей раннего возраста, пожилых и лиц с ослабленным иммунитетом вирусный гастроэнтерит может приводить к тяжёлой дегидратации, требующей госпитализации, и при отсутствии адекватной регидратации — к жизнеугрожающим состояниям.

Ротавирус серогруппы A — основная причина тяжёлого гастроэнтерита у детей до 5 лет во всём мире. До внедрения вакцинации ротавирус являлся причиной 20–60% госпитализаций по поводу диареи у детей; после введения ротавирусных вакцин в национальные календари многих стран заболеваемость значительно снизилась, однако вирус продолжает циркулировать. Наиболее тяжёлым течением характеризуется первый эпизод инфицирования; при повторных встречах с возбудителем выраженность клинических проявлений снижается, и увеличивается доля субклинических форм. Ротавирусная инфекция характеризуется обильной водянистой диареей, рвотой и лихорадкой; при остром заболевании вирусные частицы выделяются с калом в очень больших количествах. Норовирус — наиболее частая причина вирусного гастроэнтерита во всех возрастных группах и ведущий возбудитель вспышек гастроэнтерита в организованных коллективах (стационары, дома престарелых, круизные суда, детские учреждения). Геногруппы GI и GII охватывают подавляющее большинство штаммов, патогенных для человека; GII значительно преобладает. Наиболее часто реализуется контактно-бытовой путь передачи, вторым по значимости является пищевой, связанный с контаминацией продуктов. Норовирус отличается высокой контагиозностью, устойчивостью во внешней среде и способностью вызывать повторные заболевания (иммунитет непродолжителен и типоспецифичен). Наиболее активное выделение норовируса наблюдается в первые 72 часа от начала заболевания; средняя продолжительность выделения вируса с калом составляет около 14 дней, у детей дошкольного возраста и пожилых лиц она может увеличиваться в 1,5–2 раза. У пациентов с ослабленным иммунитетом норовирус может вызывать хроническую инфекцию с длительной диареей и продолжительным выделением вируса. Астровирус вызывает гастроэнтерит преимущественно у детей раннего возраста и пожилых людей; заболевание протекает, как правило, легче, чем ротавирусная инфекция, с продолжительностью клинических проявлений 2–3 дня.

Энтеровирусы (семейство Picornaviridae) не относятся к классическим возбудителям острого гастроэнтерита. Диарея может быть одним из проявлений энтеровирусной инфекции (особенно у детей), однако основное клиническое значение энтеровирусов связано с системными проявлениями — лихорадкой, менингитом, миокардитом, неонатальным сепсисом. Включение энтеровирусов в кишечную панель обусловлено тем, что кал является одним из наиболее чувствительных биоматериалов для их обнаружения, и положительный результат в кале может дополнять диагностику системных энтеровирусных инфекций. Обнаружение энтеровируса в кале требует особенно осторожной интерпретации: энтеровирусы часто выделяются с калом при бессимптомном носительстве и могут обнаруживаться в стуле длительное время после перенесённой инфекции.

Ротавирус, норовирус и астровирус передаются фекально-оральным путём (через загрязнённые руки, воду, пищу, предметы обихода), а норовирус — дополнительно воздушно-капельным путём при рвоте. Метод ПЦР обладает существенно большей чувствительностью по сравнению с иммунохроматографическими экспресс-тестами и иммуноферментным анализом (ИФА), которые традиционно применялись для диагностики вирусных гастроэнтеритов. Для норовируса ПЦР является золотым стандартом диагностики, поскольку иммунологические тесты обладают генотип-зависимой чувствительностью и не всегда выявляют новые штаммы.

Клиническое значение

Мультиплексная ПЦР кишечных вирусов решает несколько клинических задач: устанавливает вирусную этиологию острого гастроэнтерита, позволяет дифференцировать вирусную диарею от бактериальной, идентифицирует конкретный возбудитель и выявляет коинфекции — всё из одного образца кала в одном исследовании.

Дифференциальная диагностика вирусной и бактериальной диареи — практически значимый результат для большинства пациентов. Подтверждение вирусной этиологии (ротавирус, норовирус, астровирус) позволяет обоснованно воздержаться от антибактериальной терапии, которая при вирусных гастроэнтеритах неэффективна, и сосредоточиться на регидратации и симптоматическом лечении. Это особенно важно у детей раннего возраста, госпитализированных с острой диареей, когда вопрос о назначении антибиотиков стоит наиболее остро. Идентификация конкретного вируса клинически значима и за пределами выбора терапии: она позволяет прогнозировать течение (ротавирусная инфекция у детей, как правило, протекает тяжелее, чем астровирусная), принимать обоснованные решения об инфекционном контроле (изоляция, дезинфекция) и оценивать эпидемиологическую ситуацию. Для норовируса это особенно значимо: выявление норовируса у госпитализированного пациента требует немедленных противоэпидемических мероприятий для предотвращения внутрибольничной вспышки. Выявление коинфекций (одновременное инфицирование двумя и более вирусами) — дополнительное преимущество мультиплексного подхода, недоступное при использовании моноплексных тестов; коинфекции могут быть ассоциированы с более тяжёлым или затяжным течением у детей раннего возраста.

Исследование также применяется при расследовании вспышек гастроэнтерита в организованных коллективах (стационары, детские учреждения, дома престарелых, предприятия общественного питания), когда необходимо быстро установить возбудитель и определить источник инфекции. У пациентов с ослабленным иммунитетом (после трансплантации, на химиотерапии, ВИЧ-инфицированные) вирусные гастроэнтериты могут принимать хроническое течение с длительной диареей и продолжительным выделением вируса; лабораторное подтверждение этиологии определяет тактику ведения и мониторинга.

Обнаружение энтеровируса в кале в контексте данной панели имеет иное клиническое значение, чем обнаружение ротавируса, норовируса или астровируса. Положительный результат на энтеровирус не столько указывает на вирусную причину диареи (хотя это возможно), сколько может дополнять диагностику системных энтеровирусных инфекций — менингита, лихорадки без очага у детей раннего возраста, неонатального сепсиса, — поскольку стул является одним из наиболее чувствительных биоматериалов для обнаружения энтеровирусов. Положительный результат на энтеровирус в кале при наличии гастроинтестинальных симптомов требует осторожной интерпретации и соотнесения с клинической картиной.

Таким образом, мультиплексная ПЦР кишечных вирусов наиболее информативна при острых гастроэнтеритах у детей раннего возраста и пожилых (группы риска тяжёлого течения), при госпитализации по поводу диареи для обоснования отказа от антибиотиков, при расследовании вспышек в организованных коллективах и при хронической диарее у пациентов с ослабленным иммунитетом. Позиция «энтеровирус» в составе панели дополняет диагностику системных энтеровирусных инфекций, а не гастроэнтерита. Специфической противовирусной терапии большинства кишечных вирусов не существует; основой лечения остаётся регидратация и симптоматическая терапия.

Ограничения

Положительный результат подтверждает присутствие вирусной нуклеиновой кислоты в кале, но не во всех случаях означает, что обнаруженный вирус является причиной текущих симптомов. Это ограничение в наибольшей степени относится к энтеровирусам, которые часто выделяются с калом при бессимптомном носительстве и могут обнаруживаться в стуле длительное время после перенесённой инфекции. РНК норовируса также выявляется методом ПЦР в стуле до 16% здоровых лиц. Клиническая оценка необходима для определения того, является ли обнаруженный вирус причиной заболевания. 
Панель не включает ряд других вирусных возбудителей гастроэнтерита (саповирус, кишечные аденовирусы типов 40/41). Отрицательный результат по всем позициям панели не исключает инфекционный гастроэнтерит: причиной могут быть вирусы, не входящие в состав панели, бактериальные или паразитарные возбудители. 
Исследование определяет наличие или отсутствие РНК, но не измеряет вирусную нагрузку. Выделение вируса с калом может продолжаться после клинического выздоровления (особенно для ротавируса и норовируса), поэтому положительный результат не всегда свидетельствует об острой фазе заболевания. 
Максимальная информативность ПЦР достигается при заборе материала в первые 72 часа от начала заболевания. На более поздних сроках чувствительность исследования может снижаться по мере уменьшения выделения вируса. Диагностическая ценность исследования крови при острых кишечных инфекциях вирусной этиологии существенно ниже, чем исследования кала. Кал является оптимальным и приоритетным биоматериалом для ПЦР-диагностики вирусных гастроэнтеритов. 
Исследование не предназначено для контроля излеченности. Повторная ПЦР кала после клинического выздоровления не рекомендуется в рутинной практике. 
Результат исследования требует интерпретации врачом с учётом клинической картины, возраста пациента, эпидемиологического анамнеза, длительности симптомов и иммунного статуса.