Мутации BRCA1 и BRCA2 методом NGS в опухолевой ткани и крови

Рак молочной железы (рак груди) и рак яичников относятся к самым частым злокачественным опухолям у женщин. Большинство случаев носит спорадический характер, однако около 5–10% развиваются на фоне наследственной предрасположенности. Её главная форма — наследственный синдром рака молочной железы и яичников, в основе которого лежат герминальные (унаследованные) мутации генов-супрессоров опухолевого роста BRCA1 и BRCA2. У носителей таких мутаций опухоли возникают в более молодом возрасте, чаще бывают двусторонними и нередко сочетаются у одного человека или в пределах одной семьи, где случаи рака молочной железы и яичников накапливаются в нескольких поколениях. 
Гены BRCA1 и BRCA2 отвечают за точное восстановление повреждений ДНК и тем самым поддерживают генетическую стабильность клетки. Когда из-за мутации функция гена утрачивается, клетка теряет один из механизмов защиты от повреждений, постепенно накапливает поломки в собственном геноме и приобретает способность к неконтролируемому делению — так формируется злокачественная опухоль. 
Данное исследование методом секвенирования нового поколения (NGS) прочитывает кодирующую часть обоих генов целиком: 24 экзона BRCA1 и 27 экзонов BRCA2 вместе с прилегающими участками сплайсинга. В отличие от панелей частых (founder-) мутаций, проверяющих лишь несколько заранее заданных позиций, секвенирование выявляет точечные замены и небольшие вставки и делеции на всём протяжении кодирующей последовательности, в том числе редкие и ранее не описанные варианты. Исследование выполняется как по крови, так и по опухолевой ткани, и то, какую информацию даёт результат, определяется выбранным материалом.

При исследовании крови выявляются герминальные мутации, присутствующие во всех клетках организма: это оценка наследственного риска. При исследовании опухолевой ткани обнаруживаются как герминальные, так и соматические изменения, возникшие непосредственно в опухоли, что характеризует молекулярные особенности новообразования. По одному лишь опухолевому материалу отличить наследственную мутацию от приобретённой невозможно: при выявлении клинически значимого варианта в ткани для уточнения его происхождения исследуют кровь.

Клиническое значение

Обнаружение патогенного или вероятно патогенного варианта BRCA1 или BRCA2 указывает на клинически значимое изменение гена, участвующего в восстановлении ДНК. Клиническое прочтение зависит от материала. Вариант, найденный в крови, означает герминальное носительство: дефектная копия гена присутствует во всех клетках, и пожизненный риск рака молочной железы у носительниц достигает 50–80%, рака яичников — от 10–20% при мутациях BRCA2 до 40% и более при мутациях BRCA1, тогда как в общей популяции эти риски составляют около 12% и 1–2%. Вариант, выявленный в опухолевой ткани, характеризует BRCA-статус новообразования и может иметь терапевтическое значение, но сам по себе не оценивает все механизмы нарушения гомологичной рекомбинации, включая потерю второй копии гена, крупные перестройки, метилирование или общий HRD-статус опухоли.

Вариант, выявленный в опухолевой ткани, характеризует новообразование как BRCA-ассоциированное: нарушение восстановления двухцепочечных разрывов ДНК делает такие опухоли более чувствительными к препаратам платины и к ингибиторам PARP (класс таргетных препаратов, блокирующих резервный путь репарации ДНК в опухолевой клетке). Терапевтический вес результата при этом неодинаков: при раке яичников статус BRCA служит установленным фактором чувствительности к платине и применимости ингибиторов PARP, тогда как при раке молочной железы значение результата зависит от клинической ситуации и молекулярного подтипа опухоли.

Повышение риска у носителей объясняется тем, что они наследуют один уже повреждённый аллель гена во всех клетках организма; для злокачественной трансформации обычно требуется дополнительное нарушение работы второго, исходно нормального аллеля в конкретной ткани. Поэтому носительство означает предрасположенность, а не предопределённость заболевания. Если BRCA-вариант выявлен в опухолевой ткани, он может отражать важное нарушение системы восстановления ДНК, но сам по себе не доказывает полную двухаллельную инактивацию гена и не заменяет отдельную оценку HRD-статуса опухоли.

При обнаружении значимого варианта в опухоли его происхождение уточняют по крови: герминальная мутация определяется и в крови, тогда как положительный результат в ткани при отрицательном в крови соответствует соматической мутации. Соматический вариант влияет на выбор лечения, но не наследуется и не означает повышенного риска для кровных родственников. Тем самым сопоставление крови и опухоли разделяет два разных следствия — наследственный риск, определяющий программу профилактики для семьи, и приобретённые свойства опухоли, определяющие подбор системной терапии для пациента.

Подтверждённое герминальное носительство значимо и для кровных родственников: каждый из них наследует мутацию с вероятностью 50%, поэтому им может быть предложено целенаправленное тестирование на тот же вариант (каскадный скрининг). Спектр риска зависит от затронутого гена. Мутации BRCA1 ассоциированы с более ранним возрастом развития опухолей, более высоким риском рака яичников и трижды негативным подтипом рака молочной железы; мутации BRCA2 связаны с более широким кругом опухолей, включая рак предстательной и поджелудочной железы, рак молочной железы у мужчин и меланому, и чаще сопутствуют гормон-рецептор-положительным опухолям.

Выявленные варианты различаются по клинической значимости: одни достоверно патогенны, другие — доброкачественные полиморфизмы, не влияющие на риск, а часть относится к вариантам неопределённого значения, когда имеющихся данных пока недостаточно для отнесения изменения к патогенным или безвредным. Практическое значение для оценки риска и тактики наблюдения имеет только подтверждённый патогенный или вероятно патогенный вариант. Вариант неопределённого значения не приравнивается ни к патогенному, ни к норме: тактика опирается на личный и семейный анамнез, а классификация со временем уточняется по мере накопления данных и сегрегационного анализа в семьях.

Отрицательный результат означает отсутствие в генах BRCA1 и BRCA2 патогенных, вероятно патогенных вариантов и вариантов неопределённого значения и трактуется в контексте семейного анамнеза. Если в семье уже известен конкретный патогенный вариант, а у обследуемого он не обнаружен, индивидуальный риск приближается к среднепопуляционному. Если исследование проведено при выраженной семейной отягощённости без ранее установленной мутации, отрицательный результат не исключает наследственной предрасположенности в целом и направляет поиск на другие гены репарации ДНК и контроля клеточного деления (ATM, CHEK2, PALB2 и ряд других); при отрицательном результате в опухоли оценку дополняют более широким молекулярным профилированием или тестированием на дефицит гомологичной рекомбинации (HRD), поскольку дефект восстановления ДНК возможен и без мутаций BRCA. Часть мутаций самих генов BRCA также лежит за пределами разрешающей способности метода, поэтому при сохраняющемся подозрении обследование продолжают дополняющими методами.

Что влияет на результат анализа

Секвенирование выявляет точечные замены и короткие вставки и делеции в кодирующих областях и канонических сайтах сплайсинга, однако обладает известными методическими ограничениями. Оно не обнаруживает протяжённые перестройки генов (крупные делеции и дупликации целых экзонов), вставки и делеции длиной более десяти нуклеотидов, мутации в глубине интронов и варианты в состоянии мозаицизма. Для поиска крупных перестроек применяют дополнительные методы анализа числа копий участков гена. Поэтому при выраженном клиническом или семейном анамнезе отрицательный результат секвенирования не исключает наследственной предрасположенности и может потребовать дообследования. 
На результат влияет качество исследуемого материала. В опухолевой ткани значение имеют доля опухолевых клеток, объём и сохранность образца, а также правильность фиксации и подготовки материала: при низком содержании опухолевых клеток или выраженной деградации ДНК часть вариантов может остаться невыявленной, а образец — потребовать повторного исследования. Высокое и равномерное покрытие при секвенировании повышает достоверность результата. 
На трактовку результата влияет и клинический контекст. Этническое происхождение учитывается при оценке: в отдельных популяциях, в частности у евреев-ашкенази, с повышенной частотой встречаются определённые повторяющиеся (founder-) варианты, что повышает дотестовую вероятность носительства. Отягощённый семейный анамнез (ранний возраст опухолей у родственников, несколько случаев рака молочной железы или яичников, сочетание этих опухолей у одного человека) повышает вероятность наследственной предрасположенности и может быть основанием для расширенного генетического обследования. Если выявлен вариант неопределённого значения, его не приравнивают к патогенной мутации: такой результат требует экспертной интерпретации, сопоставления с семейными данными и возможной последующей переоценки по мере накопления доказательств. 
Результаты секвенирования сложны для интерпретации и оцениваются с учётом диагноза, типа и стадии опухоли, молекулярного подтипа, семейного анамнеза и цели обследования. Решение о терапии, необходимости исследования крови, расширенного генетического анализа или обследования родственников принимает лечащий врач совместно с онкологом и, при необходимости, врачом-генетиком.