Мутации BRCA1, BRCA2, ATM, PALB2, CHEK2 методом NGS в опухолевой ткани и крови

Рак молочной железы (рак груди) и рак яичников — частые злокачественные опухоли, и часть случаев имеет наследственную природу. Наследственная предрасположенность к ним, а также к раку поджелудочной железы, предстательной железы и желудка, связана с мутациями в нескольких генах, которые в норме отвечают за восстановление повреждений ДНК. У людей с такими мутациями опухоли чаще возникают в молодом возрасте, могут быть двусторонними или множественными и нередко накапливаются в семье среди близких родственников. 
Данное исследование охватывает пять генов (BRCA1, BRCA2, ATM, PALB2 и CHEK2), которые работают как звенья единой системы восстановления повреждений ДНК и в норме сдерживают опухолевый рост. Мутации в этих генах повышают риск злокачественных опухолей, но в разной степени: при мутациях BRCA1, BRCA2 и PALB2 риск повышается значительно, при мутациях ATM и CHEK2 — умеренно.  Каждый ген исследуется целиком, анализируется вся кодирующая последовательность с прилегающими каноническими сайтами сплайсинга. Методом секвенирования (NGS) выявляются однонуклеотидные замены и короткие вставки и делеции; результат формируется раздельно по каждому гену с указанием обнаруженных патогенных, вероятно патогенных вариантов и вариантов неопределённого значения. 
Исследование выполняется как по крови, так и по опухолевой ткани. По крови выявляют наследственные (герминальные) мутации, присутствующие во всех клетках организма, поэтому метод используют для оценки наследственного риска для пациента и его родственников. По опухолевой ткани обнаруживают и герминальные, и соматические (возникшие только в опухоли) варианты, что характеризует свойства самого новообразования. По одному лишь опухолевому материалу отличить наследственную мутацию от приобретённой нельзя: при выявлении значимого варианта в ткани для уточнения его происхождения исследуют кровь.

Клиническое значение

Выявление патогенного или вероятно патогенного варианта свидетельствует о нарушении функции одного из исследуемых генов и ассоциировано с повышенным онкологическим риском, величина которого определяется как самим геном, так и характером варианта. BRCA1, BRCA2 и PALB2 относятся к высокопенетрантным генам, ATM и CHEK2 — к генам умеренной пенетрантности; при этом варианты, обрывающие белок (нонсенс-замены и сдвиг рамки считывания), как правило, патогеннее миссенс-замен со сниженной активностью, часть которых отнесена к низкопенетрантным и в изолированном виде клинически не значима. Пенетрантность неполная, а экспрессивность вариабельна: онкологический риск реализуется не у каждого носителя и не достигает 100% в течение жизни, а фенотип может различаться даже в пределах одной семьи. Поэтому носительство трактуется как предрасположенность, а не предопределённость заболевания, что особенно существенно при интерпретации находки у бессимптомного носителя.

Все пять генов участвуют в едином пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК посредством гомологичной рекомбинации, образуя последовательный сигнально-репарационный каскад. ATM представляет собой апикальную киназу, которая распознаёт двухцепочечный разрыв и инициирует ответ на повреждение ДНК: остановку клеточного цикла, репарацию или, при неустранимом повреждении, апоптоз. CHEK2 — эффекторная киназа, передающая сигнал ATM и реализующая остановку клеточного цикла до завершения репарации. BRCA1, PALB2 и BRCA2 обеспечивают собственно гомологичную рекомбинацию, причём PALB2 служит молекулярным мостом, физически объединяющим BRCA1 и BRCA2 в репарационный комплекс. Утрата функции любого звена нарушает высокоточную репарацию, клетка переключается на резервные, склонные к ошибкам механизмы починки, что ведёт к накоплению повреждений и нестабильности генома.

Интерпретация зависит и от исследуемого материала. Вариант, выявленный в крови, отражает герминальное носительство и характеризует наследственный риск. Вариант в опухолевой ткани характеризует молекулярный профиль новообразования и может иметь как герминальное, так и соматическое происхождение, не различимое в пределах одного лишь опухолевого материала. При выявлении клинически значимого варианта в опухоли его происхождение верифицируют по крови: герминальный вариант присутствует и в крови, тогда как вариант, ограниченный опухолью, расценивается как соматический — он значим для молекулярной характеристики опухоли и выбора терапии, но не наследуется и не повышает риск у кровных родственников.

Онкологический спектр гетерогенен и зависит от затронутого гена. Патогенные варианты BRCA1 ассоциированы преимущественно с раком молочной железы (нередко трижды негативного фенотипа и с ранним возрастом манифестации) и с высоким риском рака яичников. Варианты BRCA2 сопряжены с раком молочной железы и яичников, а также раком предстательной и поджелудочной железы, раком грудной железы у мужчин и меланомой. Патогенные варианты PALB2 по величине риска приближаются к BRCA2, повышая риск рака молочной железы, поджелудочной железы и, в меньшей степени, яичников. ATM и CHEK2 ассоциированы прежде всего с умеренно повышенным риском рака молочной железы; для ATM дополнительно описаны рак поджелудочной, предстательной железы и желудка, для CHEK2 — рак предстательной железы у мужчин. Суммарно панель охватывает наследственную предрасположенность к раку молочной железы, яичников, поджелудочной, предстательной железы и желудка.

Перечисленные риски относятся к моноаллельному (гетерозиготному) носительству. Биаллельная инактивация (гомозиготная либо компаунд-гетерозиготная) реализует самостоятельные аутосомно-рецессивные синдромы: биаллельные варианты BRCA2 или PALB2 служат молекулярным критерием анемии Фанкони, а биаллельные варианты ATM лежат в основе атаксии-телеангиэктазии с неврологической симптоматикой и выраженной радиочувствительностью. Поэтому при выявлении двух патогенных вариантов в одном гене целесообразно обследование родителей для определения цис- или транс-положения вариантов, которое самим секвенированием не устанавливается.

Подтверждённое герминальное носительство значимо как для пациента, так и для кровных родственников: у пациента оно учитывается при формировании программы наблюдения и оценке риска вторых первичных опухолей, а родственникам, каждый из которых наследует вариант с вероятностью 50%, показан каскадный скрининг на семейный вариант. Клинически значима и предиктивная роль результата: дефицит гомологичной рекомбинации повышает чувствительность опухоли к препаратам платины и к ингибиторам PARP, действие которых основано на синтетической летальности — блокаде резервного пути репарации в клетках, уже утративших гомологичную рекомбинацию. Эта зависимость наиболее доказана для рака яичников и опухолей с мутациями BRCA1 и BRCA2; для PALB2 и ATM она менее установлена, а итоговое терапевтическое значение определяется нозологией, стадией и молекулярным подтипом опухоли.

Помимо патогенных, секвенирование может выявить вариант неопределённого значения — изменение с пока не доказанным влиянием на функцию белка и онкологический риск. Подобный результат не приравнивается к патогенному варианту и сам по себе не служит основанием для риск-редуцирующих операций, изменения терапии или каскадного тестирования родственников; тактика определяется индивидуально с учётом семейного анамнеза, а классификация может пересматриваться по мере накопления данных и результатов сегрегационного анализа. Интерпретация таких вариантов входит в компетенцию врача-генетика.

Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии в исследованных генах патогенных, вероятно патогенных вариантов и вариантов неопределённого значения. Он снижает вероятность наследственной формы заболевания, но не исключает её: предрасположенность может быть обусловлена другими генами либо классами вариантов, лежащими за пределами разрешающей способности метода, а дефицит гомологичной рекомбинации в опухоли возможен и в отсутствие выявляемой мутации. При отрицательном результате в опухолевом материале оценку при необходимости дополняют расширенным молекулярным профилированием или тестированием на дефицит гомологичной рекомбинации (HRD).

Что влияет на результат анализа

Секвенирование выявляет точечные замены и короткие вставки и делеции в кодирующих областях и канонических сайтах сплайсинга, но имеет известные ограничения. Оно не обнаруживает протяжённые перестройки генов (крупные делеции и дупликации экзонов), вставки и делеции длиной более десяти нуклеотидов, мутации в глубине интронов и варианты в состоянии мозаицизма. Поэтому отрицательный результат не исключает наследственной предрасположенности полностью, и при выраженном клиническом или семейном анамнезе может потребоваться дообследование другими методами. На результат влияет качество исследуемого материала. В опухолевой ткани значение имеют доля опухолевых клеток в образце, объём и сохранность материала, правильность фиксации и подготовки, а также пригодность ДНК для секвенирования. Если опухолевых клеток мало, ткань выраженно изменена после лечения, некротизирована или ДНК значительно деградирована, часть вариантов может остаться невыявленной либо исследование может потребовать другого биопсийного или операционного образца. Высокое и равномерное покрытие при секвенировании повышает достоверность результата. Выявленные патогенные и вероятно патогенные варианты при необходимости подтверждают независимым методом, например секвенированием по Сэнгеру, чтобы снизить вероятность технической ошибки.  
На трактовку влияет и клинический контекст. Пол носителя смещает спектр рисков: при одной и той же мутации у женщин на первый план выходят рак молочной железы и яичников, у мужчин — рак предстательной и поджелудочной железы и рак молочной железы у мужчин. Этническое происхождение учитывается при оценке: в отдельных популяциях (например, у евреев-ашкенази) с повышенной частотой встречаются определённые повторяющиеся варианты, что повышает дотестовую вероятность носительства. Отягощённый семейный анамнез (ранний возраст опухолей у родственников, несколько случаев рака молочной железы или яичников, сочетание этих опухолей у одного человека) повышает вероятность наследственной природы и увеличивает значимость находок.