Определение генотипа резус-фактора

Исследование определяет генотип гена RHD в геномной ДНК, выделенной из венозной крови. Результат уточняет истинную резус-принадлежность, когда серология дала неоднозначный ответ.

Анализ выполняется методом ПЦР и выявляет ключевые участки гена RHD , кодирующего белок D системы Резус. В зависимости от конструкции тест-системы исследуются характерные экзоны (чаще 5, 7, 10) и/или области, позволяющие отличить функционально активный аллель от нефункционального псевдогена RHDψ , распространённого у лиц африканского происхождения, а также от гибридных аллелей RHD-CE-D . Результат выдаётся в формате обнаружено / не обнаружено для каждой исследуемой мишени с итоговой интерпретацией предполагаемого генотипа: RHD +/+, RHD +/− или RHD −/−.

В отличие от серологического типирования, которое оценивает антиген D на мембране эритроцитов с помощью анти-D реагентов, молекулярно-генетическое исследование анализирует саму последовательность гена. Это принципиально важно в случаях, когда серологический ответ классифицируется как сомнительный, слабый или дискордантный между разными реагентами и методиками. Генетический статус не зависит от плотности антигена на эритроцитах, от возраста эритроцитов, недавних гемотрансфузий донорской крови (при исследовании ДНК лейкоцитов реципиента результат отражает собственный генотип) и от иных факторов, влияющих на серологию.

Биоматериал — цельная венозная кровь с ЭДТА; источником ДНК служат ядросодержащие клетки (лейкоциты). Исследование не определяет антигены C, c, E, e системы Резус и другие групповые системы; для этого используются отдельные серологические или молекулярные тесты.

Клиническое значение

Основное показание — уточнение резус-принадлежности при сомнительных, слабых или противоречивых результатах серологического типирования антигена D. Такая ситуация возникает при вариантах weak D (снижено число копий нормального антигена), partial D (изменена антигенная структура с выпадением отдельных эпитопов) и DEL (антиген выявляется только адсорбцией-элюцией). Для каждой группы принята разная клиническая тактика: носители типов weak D 1, 2 и 3 в современных протоколах могут рассматриваться как резус-положительные и безопасно получать D-положительную кровь, тогда как partial D и большинство иных слабых вариантов требуют ведения как D-отрицательных реципиентов и кандидатов на анти-D иммунопрофилактику. Определение генотипа помогает корректно отнести пациента к одной из этих категорий.

Второе стандартное применение — акушерская практика. У женщин с неясным серологическим статусом D решение о назначении анти-D иммуноглобулина и о необходимости мониторинга резус-конфликта опирается на молекулярное подтверждение генотипа: истинно D-отрицательные пациентки нуждаются в профилактике, тогда как носители большинства weak D вариантов — нет. При повторных сомнительных результатах у беременной генотипирование RHD позволяет принять обоснованное решение о тактике ведения.

Исследование также применяется у доноров крови при расхождении результатов типирования между реагентами или лабораториями, у реципиентов перед плановыми трансфузиями при неоднозначной серологии и у пациентов, которым ранее переливалась кровь и чей собственный фенотип сложно оценить серологически. У лиц африканского происхождения генотипирование помогает отличить функциональный аллель от псевдогена RHDψ , который серологически выглядит как D-отрицательный, но несёт участки гена RHD .

Тест наиболее информативен тогда, когда серологический результат уже получен и классифицирован как сомнительный, а клиническое решение (трансфузия, иммунопрофилактика, ведение беременности) зависит от истинного резус-статуса. В качестве первичного скрининга резус-принадлежности у здоровых лиц без серологических расхождений молекулярное исследование не требуется.

Ограничения метода

Обнаружение целевых фрагментов гена RHD подтверждает их наличие в геноме, но не всегда указывает на полноценную экспрессию антигена D на мембране эритроцитов: отдельные молчащие аллели и редкие варианты могут давать положительный ПЦР-сигнал при фактически D-отрицательном фенотипе. Отсутствие исследуемых мишеней с высокой вероятностью соответствует D-отрицательному генотипу, однако не исключает редких вариантов, не охваченных конкретной тест-системой, включая некоторые гибридные и мутантные аллели. Тест не различает все известные подтипы weak D и partial D, если панель мишеней на это не рассчитана; для полной характеристики варианта может потребоваться расширенное генотипирование или секвенирование. Результат отражает генотип субъекта только при условии, что исследуется собственная ДНК пациента; массивные недавние гемотрансфузии и трансплантация костного мозга могут искажать интерпретацию. Исследование не заменяет серологическое типирование и не определяет антигены C, c, E, e, а также фенотип Kell, Duffy, Kidd и других систем. Пре-аналитические факторы — гемолиз, свёртывание пробы, недостаточный объём, неверный антикоагулянт — снижают качество выделения ДНК и могут приводить к неинформативному результату. Результат исследования требует интерпретации врачом с учётом серологических данных, акушерского и трансфузиологического анамнеза, клинической ситуации и, при необходимости, результатов расширенного молекулярного анализа.