ПЦР-диагностика хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) в биоптатах слизистой желудка и дпк

Анализ выявляет ДНК Helicobacter pylori в биоптате слизистой оболочки желудка методом ПЦР. Результат выдаётся в формате обнаружено / не обнаружено. Исследование применяется для этиологической диагностики H. pylori-ассоциированных заболеваний — хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, MALT-лимфомы и в рамках оценки риска развития рака желудка — когда пациенту выполняется эзофагогастродуоденоскопия с биопсией. Биоптат слизистой желудка — один из валидных материалов для прямого выявления возбудителя: наряду с быстрым уреазным тестом, гистологическим и культуральным исследованием, молекулярные методы входят в стандартный диагностический арсенал при эндоскопии.

Helicobacter pylori — грамотрицательная спиральная бактерия с несколькими униполярными жгутиками, обеспечивающими подвижность в вязком слое желудочной слизи. Ключевой фактор выживания возбудителя в кислой среде желудка — активная продукция уреазы, расщепляющей мочевину до аммиака и создающей локальную нейтрализацию вокруг бактерии. Адгезия к поверхностному эпителию, продукция вакуолизирующего цитотоксина VacA и островок патогенности cagA определяют воспалительный ответ и долгосрочные последствия инфекции. 
H. pylori — одна из наиболее распространённых хронических бактериальных инфекций: носительство охватывает более половины населения мира, с региональными колебаниями от менее 20% в ряде развитых стран до более 80% в развивающихся. Заражение происходит преимущественно в детском возрасте фекально-оральным и орально-оральным путями, в дальнейшем инфекция персистирует в слизистой желудка на протяжении десятилетий. 
Клинический спектр H. pylori-ассоциированных состояний широк. Хронический активный гастрит развивается у подавляющего большинства инфицированных; у части пациентов процесс прогрессирует до атрофического гастрита, кишечной метаплазии и дисплазии — этапов каскада Correa, ведущих к развитию аденокарциномы желудка. H. pylori признан канцерогеном первого порядка и главной предотвратимой причиной рака желудка. Инфекция ассоциирована с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, MALT-лимфомой желудка (эрадикация возбудителя ведёт к регрессии опухоли в ранних стадиях), а также с рядом внежелудочных состояний — железодефицитной анемией неясного генеза, идиопатической тромбоцитопенической пурпурой, дефицитом витамина B12.

Отдельную клиническую проблему представляет антибактериальная устойчивость возбудителя. Рост резистентности к кларитромицину, левофлоксацину и метронидазолу в большинстве регионов привёл к пересмотру стратегии лечения: современные рекомендации смещаются в сторону резистентность-направленного подхода. Определение мутаций устойчивости выполняется отдельными молекулярными исследованиями либо культуральным методом с оценкой чувствительности и в задачи данного качественного теста на выявление ДНК не входит.

ПЦР выявляет специфические участки генома H. pylori — чаще всего фрагменты генов 16S рРНК, ureA (уреаза) или vacA — и обладает высокой аналитической чувствительностью и специфичностью. Преимущества метода перед культуральным исследованием — скорость и отсутствие требований к специальным условиям транспортировки (культура H. pylori требовательна к среде и к скорости доставки и выполняется в ограниченном числе лабораторий). Преимущество перед быстрым уреазным тестом — более высокая клиническая чувствительность при низкой бактериальной нагрузке. ПЦР детектирует ДНК, а не жизнеспособные бактерии, что имеет значение для интерпретации контрольных исследований после терапии.

Клиническое значение

Исследование применяется для подтверждения H. pylori-инфекции при эндоскопической верификации заболеваний желудка в сочетании с другими методами оценки биоптата — быстрым уреазным тестом и гистологическим исследованием. Основные клинические сценарии включают первичную диагностику инфекции у пациентов, которым по клиническим показаниям выполняется эндоскопия с биопсией: при язвенной болезни, тревожных симптомах, подозрении на атрофический гастрит, кишечную метаплазию, предраковые изменения или других состояниях, требующих эндоскопической оценки слизистой желудка. Возрастной порог для ЭГДС при диспепсии определяется действующими клиническими рекомендациями и популяционным риском.

Отдельное практическое применение — повторное использование биоптата, уже взятого для быстрого уреазного теста. Современные рекомендации допускают такое использование: после завершения RUT материал из тест-тампона пригоден для ПЦР-анализа, что сокращает число дополнительных биопсий. Особую ценность такой подход имеет при отрицательном RUT у пациентов с клиническим подозрением на инфекцию — повторный анализ того же биоптата молекулярным методом повышает диагностическую чувствительность.

Для контроля эффективности эрадикационной терапии ПЦР биоптата, как правило, не применяется. Стандартный подход — 13C-уреазный дыхательный тест или определение антигена H. pylori в кале, выполняемые не ранее чем через 4 недели после завершения антибактериальной терапии и не менее чем через 14 дней после отмены ингибиторов протонной помпы. Эти методы неинвазивны, не требуют повторной эндоскопии и валидированы для посттерапевтического контроля. Эндоскопия с биопсией и исследование биоптата при контроле лечения рассматриваются только при наличии независимых показаний к повторной эндоскопии — например, при контроле заживления язвы желудка или оценке регрессии MALT-лимфомы.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности: положительный результат подтверждает присутствие генетического материала H. pylori в исследованной пробе, но при контрольном исследовании в короткие сроки после терапии может давать ложноположительный результат за счёт остаточной ДНК уже эрадикированного возбудителя. Именно поэтому ПЦР биоптата не является предпочтительным методом посттерапевтического контроля; для этой задачи используются 13C-уреазный дыхательный тест или антигенный тест кала. Ложноположительные результаты возможны также за счёт перекрёстной детекции представителей рода Helicobacter non-pylori при использовании неспецифичных праймеров. Ложноотрицательные результаты встречаются при низкой бактериальной нагрузке, наличии ингибиторов ПЦР в пробе и при так называемой «пятнистой» колонизации слизистой, когда возбудитель распределён неравномерно и биоптат может быть взят вне очага. Для повышения диагностической чувствительности рекомендуется получение нескольких биоптатов из разных отделов желудка в соответствии с валидированным протоколом. На результат влияет предшествующий приём ингибиторов протонной помпы, препаратов висмута и антибактериальных средств: эти препараты подавляют возбудителя и снижают чувствительность всех методов прямой детекции, поэтому перед исследованием ингибиторы протонной помпы отменяются не менее чем за 14 дней, антибактериальные препараты и препараты висмута — не менее чем за 4 недели. Качественное исследование подтверждает только наличие или отсутствие ДНК H. pylori и не определяет чувствительность возбудителя к антибактериальным препаратам; при необходимости оценки резистентности выполняются отдельные молекулярные исследования либо культуральное исследование с определением чувствительности. Результат требует интерпретации врачом — гастроэнтерологом или врачом общей практики — с учётом клинической картины, данных эндоскопии и гистологического исследования, анамнеза ранее проводимой терапии и региональной эпидемиологической ситуации по устойчивости H. pylori.