ПЦР-диагностика коклюша (Bordetella spp.), соскобы из разных локусов

Анализ выявляет ДНК микроорганизмов рода Bordetella в мазке методом ПЦР. Результат выдаётся на уровне рода в формате обнаружено / не обнаружено. Исследование направлено на этиологическую верификацию коклюша — острого инфекционного заболевания, вызываемого Bordetella pertussis, — а также на выявление других видов этого рода, способных вызывать сходные с коклюшем инфекции дыхательных путей. Референсным биоматериалом для молекулярной диагностики коклюша служит назофарингеальный материал — мазок из носоглотки гибким тонким тампоном с синтетическим наконечником или назофарингеальный аспират (смыв). Именно на этих материалах реализуется клиническая чувствительность метода, и именно они указаны в клинических рекомендациях как диагностически адекватные. Альтернативные биоматериалы — мазок из зева и мокрота — принимаются лабораторией в ситуациях, когда получение назофарингеального материала невозможно или затруднено, однако обладают существенно меньшей клинической чувствительностью: B. pertussis имеет строгую тропность к цилиндрическому эпителию носоглотки и в ротоглотке присутствует в существенно меньшей концентрации, а в мокроте выявляется ограниченно, поскольку кашель при коклюше обычно малопродуктивный. Хлопковые тампоны для молекулярной диагностики не используются — они ингибируют ПЦР.

Коклюш — острая инфекционная болезнь, классическим возбудителем которой служит Bordetella pertussis, специфический патоген человека. Заболевание передаётся воздушно-капельным путём и характеризуется длительным течением с характерным спазматическим кашлем. Коклюш относится к управляемым вакциной инфекциям и подлежит обязательной регистрации в рамках санитарно-эпидемиологического надзора. Несмотря на массовую вакцинацию, инфекция продолжает активно циркулировать в популяции: защитный иммунитет после вакцинации и перенесённого заболевания со временем снижается, и возбудитель циркулирует среди подростков и взрослых с часто атипичной клинической картиной, на фоне чего серьёзному риску подвергаются невакцинированные младенцы — возрастная группа, в которой коклюш остаётся потенциально жизнеугрожающим.

Род Bordetella помимо B. pertussis включает B. parapertussis — возбудитель паракоклюша, клинически сходного с коклюшем, но обычно более лёгкого заболевания, не предотвращаемого коклюшной вакциной; B. bronchiseptica — первичного возбудителя респираторных инфекций у животных (собак, кошек, свиней, кроликов), у человека клинически значимого редко, преимущественно у иммунокомпрометированных пациентов и лиц с тесным профессиональным контактом с животными; а также несколько других видов, клиническое значение которых у человека ограничено или отсутствует. Центр клинической значимости рода — коклюш, вызываемый B. pertussis.

Клиническая картина классического коклюша развивается поэтапно. Катаральная фаза продолжительностью одна-две недели проявляется неспецифическими симптомами респираторной инфекции — насморком, умеренным кашлем, субфебрильной лихорадкой — и часто не вызывает подозрения на коклюш у клинициста. Пароксизмальная фаза (вторая-шестая неделя болезни) характеризуется приступами спазматического кашля с серией коротких кашлевых толчков, заканчивающихся громким шумным вдохом (репризой), нередко — рвотой после кашлевого приступа и цианозом лица; между приступами пациент может выглядеть относительно благополучно. Фаза реконвалесценции длится неделями и месяцами, с постепенным уменьшением частоты и выраженности приступов. У привитых и ранее переболевших пациентов, у подростков и взрослых клиническая картина часто атипична: длительный сухой кашель без характерных пароксизмов, иногда с ночными приступами, сохраняющийся неделями. У младенцев первых месяцев жизни коклюш протекает наиболее тяжело: возможны апноэ, цианоз, судорожные эквиваленты, требующие интенсивной терапии.

Диагностические характеристики ПЦР при коклюше имеют важную временную специфику, принципиальную для корректной интерпретации результата, и раскрываются в полной мере только при исследовании назофарингеального материала. Чувствительность метода максимальна в раннюю фазу заболевания — в катаральной и ранней пароксизмальной стадии, обычно в первые две-три недели от начала кашля, когда возбудитель активно размножается и присутствует в носоглотке в высокой концентрации. По мере прогрессирования заболевания количество возбудителя в носоглотке снижается, и после четвёртой недели от начала кашля чувствительность ПЦР существенно падает; у пациентов, обследованных в поздние сроки заболевания, отрицательный результат ПЦР не исключает коклюша, и приоритет этиологической диагностики смещается на серологическое исследование — определение специфических антител к коклюшному токсину (IgG анти-PT). Это временное распределение чувствительности методов — ключевой фактор выбора диагностического подхода в зависимости от сроков обращения пациента.

Лабораторная диагностика коклюша исторически включала культуральное исследование — посев носоглоточного материала на селективные среды (среда Борде-Жангу, Регана-Лоу); метод высокоспецифичен, но обладает невысокой чувствительностью, требует длительного инкубирования и специальных условий, и в современной практике выполняется ограниченно. Молекулярные методы обеспечивают значительно более высокую чувствительность и быстрый ответ, и в большинстве клинических лабораторий они стали основным методом этиологической диагностики коклюша в ранние сроки. Серологические методы дополняют молекулярную диагностику в поздние сроки заболевания и при ретроспективной оценке.

ПЦР выявляет консервативные участки генома, специфичные для рода Bordetella, и обеспечивает обнаружение возбудителя на родовом уровне. Метод не зависит от жизнеспособности микроорганизма и сохраняет чувствительность при ранней антибактериальной терапии, хотя и она снижает концентрацию возбудителя в пробе. Тест даёт ответ о присутствии представителей рода Bordetella, не разграничивая отдельные виды; видовая идентификация — разграничение B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica — при клинической необходимости выполняется отдельным молекулярным исследованием с видоспецифическими мишенями.

Клиническое значение

Основной клинический сценарий применения исследования — этиологическая верификация у пациентов с клинической картиной, подозрительной на коклюш: длительным кашлем, прогрессирующим с неспецифических простудных симптомов к характерным пароксизмам; приступообразным кашлем с репризами или рвотой после кашля; длительным сухим кашлем у подростков и взрослых, сохраняющимся более двух-трёх недель без очевидной причины. Молекулярное тестирование наиболее информативно в первые две-три недели от начала кашля при исследовании назофарингеального материала и в этом окне служит основным инструментом этиологической диагностики; при исследовании мазка из зева или мокроты чувствительность метода ниже даже в оптимальные сроки, что должно учитываться при интерпретации отрицательного результата.

Отдельное клинически значимое применение — обследование младенцев с респираторной симптоматикой, особенно с апноэ или атипичной клинической картиной, в контексте возможного заражения от кого-либо из членов семьи с длительным кашлем. Раннее этиологическое подтверждение инфекции из рода Bordetella у младенца имеет критически важное клиническое значение: заболевание в этой возрастной группе потенциально тяжёлое, требует госпитализации и специфической терапии, а выявленный случай запускает санитарно-эпидемиологические мероприятия в семейном окружении.

Третий клинический сценарий — обследование в очагах коклюша. При выявлении случая заболевания в организованном коллективе, в семье проводится обследование контактных лиц с симптомами респираторной инфекции, принимаются меры по предотвращению распространения инфекции. Работа с очагом коклюша регулируется действующими санитарно-эпидемиологическими правилами и клиническими рекомендациями, включая рекомендации Роспотребнадзора по профилактике коклюшной инфекции.

Положительный результат у пациента с соответствующей клинической картиной — длительным кашлем, пароксизмальным характером кашля, возможным контактом с больным — подтверждает инфекцию из рода Bordetella и в клинической ситуации, типичной для коклюша, рассматривается как этиологическое подтверждение коклюшной инфекции. Это основание для назначения этиотропной антибактериальной терапии препаратами группы макролидов, особенно эффективной в ранние сроки заболевания. Помимо влияния на индивидуальную клинику, своевременная терапия ограничивает эпидемиологическую опасность пациента для контактных лиц. Запускаются также санитарно-эпидемиологические мероприятия — регистрация случая, обследование контактных, при необходимости профилактическое лечение близких младенческого возраста.

В отдельных клинических ситуациях — прежде всего при клинической картине, подозрительной на паракоклюш, или при необходимости точной видовой идентификации для эпидемиологического анализа — после положительного результата на уровне рода может потребоваться дополнительное исследование с видовой идентификацией.

Отрицательный результат снижает вероятность участия возбудителей рода Bordetella в клинической картине, но должен интерпретироваться с учётом сроков обследования и типа биоматериала. У пациента, обследованного поздно — после четвёртой недели от начала кашля, — отрицательный результат ПЦР не исключает коклюш, и при клиническом подозрении диагностика дополняется серологическим исследованием IgG-антител к коклюшному токсину. При отрицательном результате, полученном на мазке из зева или мокроте у пациента с высоким клиническим подозрением на коклюш, обследование должно быть дополнено исследованием назофарингеального материала, обеспечивающего максимальную чувствительность метода. У пациента с длительным кашлем и отрицательным результатом при исследовании назофарингеального материала в оптимальном временном окне диагностический поиск смещается на другие возможные причины — инфекции Mycoplasma pneumoniae и Chlamydia pneumoniae, вирусные инфекции, неинфекционные причины длительного кашля (бронхиальная астма, гастроэзофагеальный рефлюкс, постинфекционный кашель).

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Тест даёт ответ на уровне рода Bordetella и не разграничивает отдельные виды этого рода; в подавляющем большинстве клинических ситуаций положительный результат при соответствующей клинической картине отражает именно B. pertussis как наиболее распространённого возбудителя рода у человека, однако при необходимости видовой идентификации — например, для разграничения коклюша от паракоклюша или для эпидемиологического расследования — выполняется отдельное молекулярное исследование с видоспецифическими мишенями. Клиническая чувствительность исследования критически зависит от типа биоматериала: назофарингеальный материал — мазок из носоглотки или назофарингеальный аспират — служит референсным биоматериалом и обеспечивает максимальную чувствительность метода; мазок из зева и мокрота существенно уступают по чувствительности и применяются только как альтернативные биоматериалы в ситуациях, когда получение назофарингеального материала невозможно. Чувствительность метода также имеет выраженную зависимость от сроков заболевания: максимальна в первые две-три недели от начала кашля, значительно снижается после четвёртой недели; у пациентов, обследованных в поздние сроки, отрицательный результат не исключает коклюш, и при клиническом подозрении диагностика дополняется серологическим исследованием. Другие возбудители коклюшеподобного синдрома — M. pneumoniae, C. pneumoniae, респираторные вирусы — данным исследованием не детектируются и при клинической необходимости их этиологической диагностики выполняются отдельные исследования. На чувствительность метода влияет предшествующая системная антибактериальная терапия, прежде всего препаратами группы макролидов, снижающая количество возбудителя в пробе. Качество забора материала имеет существенное значение: применяются гибкие тонкие тампоны с синтетическим наконечником (дакрон, нейлон), хлопковые тампоны для молекулярной диагностики не используются из-за ингибирующего влияния на реакцию. Культуральное исследование, необходимое для определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам и для эпидемиологического расследования с типированием штаммов, ПЦР не заменяет. Результат исследования требует интерпретации врачом — инфекционистом, педиатром, терапевтом, пульмонологом — с учётом клинической картины, сроков заболевания, эпидемиологического анамнеза, вакцинального статуса пациента, результатов серологического обследования при его выполнении и общей клинической ситуации.