ПЦР-диагностика коклюша (Bordetella pertussis), паракоклюша ((Bordetella parapertussis) и бронхосептикоза (Bordetella bronchiseptica) в мазке

Анализ выявляет ДНК трёх видов рода Bordetella — B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica — в одной пробе методом ПЦР. Результат по каждому из возбудителей выдаётся в формате обнаружено / не обнаружено. Стандартный биоматериал для молекулярной диагностики этой группы инфекций — назофарингеальный мазок или назофарингеальный аспират; именно эти материалы рекомендуются действующими международными руководствами и обеспечивают максимальную диагностическую чувствительность метода.

Молекулярное тестирование — рекомендованный метод острой диагностики коклюша и паракоклюша. Культуральное исследование на специализированных средах сохраняет высокую специфичность, но существенно уступает ПЦР по чувствительности и скорости получения результата. Серологические методы информативны преимущественно в поздние сроки заболевания — обычно через 2–8 недель от начала кашля, когда бактериальная нагрузка в дыхательных путях уже снижается и чувствительность ПЦР падает; при этом в современной практике диагностическую ценность имеют и single-point исследования с определением антител класса IgG к коклюшному токсину, а не только парные сыворотки. Включение B. bronchiseptica в одну панель с возбудителями коклюша и паракоклюша обусловлено как клиническим сходством симптоматики респираторных инфекций, так и техническими особенностями молекулярных мишеней, используемых в ряде тест-систем.

Bordetella pertussis — возбудитель коклюша, строго человеческий патоген. Передача происходит воздушно-капельным путём; заражённый человек может оставаться заразным в течение нескольких недель. Возбудитель заселяет реснитчатый эпителий дыхательных путей, продуцирует коклюшный токсин и ряд других факторов вирулентности, нарушает мукоцилиарный клиренс и вызывает характерное воспаление. 
Клиническая картина коклюша у непривитых пациентов и пациентов с угасшим поствакцинальным иммунитетом проходит через три стадии. Катаральный период продолжается 1–2 недели и проявляется неспецифическими респираторными симптомами, напоминающими обычную ОРВИ: насморк, субфебрильная температура, умеренный кашель. Именно в этот период возбудитель выделяется в наибольших количествах, и диагностическая чувствительность ПЦР максимальна. Пароксизмальный период длится от 2 до 6 недель и характерен приступами мучительного спастического кашля с репризами — свистящим вдохом после серии кашлевых толчков — и нередко с посткашлевой рвотой. Период разрешения — постепенный регресс симптомов на протяжении недель. 
У младенцев первого полугодия жизни типичная клиническая картина часто отсутствует: ведущими проявлениями становятся приступы апноэ, цианоза, брадикардии без характерного свистящего вдоха. Именно эта возрастная группа — главная по риску летального исхода и тяжёлых осложнений (пневмония, энцефалопатия, лёгочная гипертензия). У подростков и взрослых коклюш часто протекает атипично: длительный кашель, превышающий 2 недели, без характерных приступов — нередко единственное клиническое проявление. Эта стёртая форма у взрослых служит основным источником заражения младенцев, не достигших возраста вакцинации. 
Эпидемиологически коклюш сохраняет значимое место в структуре респираторных инфекций, в том числе в России и сопредельных странах, с периодическими подъёмами заболеваемости, преимущественно среди подростков, взрослых с угасшим иммунитетом и невакцинированных младенцев. Защита после перенесённого коклюша и после вакцинации со временем снижается — ни одно из этих событий не обеспечивает пожизненного иммунитета.

Bordetella parapertussis — возбудитель паракоклюша, клинически близкого к коклюшу, но, как правило, более лёгкого заболевания. Клиническая картина может повторять коклюшные стадии, но приступы кашля обычно менее выражены, пароксизмальный период короче, осложнения реже. Принципиально важно: коклюшные вакцины против паракоклюша не защищают. Это определяет возможность паракоклюша у полностью вакцинированных детей и объясняет, почему клиническая картина коклюшеподобного заболевания у привитого пациента не исключает инфекционную этиологию из группы Bordetella.

Bordetella bronchiseptica — преимущественно зоонозный возбудитель: у собак вызывает инфекционный трахеобронхит (так называемый питомниковый кашель), у свиней — атрофический ринит, инфицирует также кошек и ряд других млекопитающих. У человека B. bronchiseptica вызывает инфекции редко и ведёт себя как оппортунистический патоген. Группы риска — иммунокомпрометированные пациенты (ВИЧ-инфекция с выраженной иммуносупрессией, реципиенты трансплантатов, онкологические пациенты на химиотерапии) и лица с тесным контактом с животными. Клинические формы у человека включают бронхит, пневмонию, реже — бактериемию, абсцессы, эндокардит. В отличие от B. pertussis, B. bronchiseptica устойчива к ряду макролидов; терапевтический выбор опирается на тетрациклины, фторхинолоны, триметоприм-сульфаметоксазол.

ПЦР-мишенями для видов Bordetella служат инсерционные последовательности и видоспецифичные гены. Для B. pertussis наиболее распространённая мишень — IS481, многокопийная инсерционная последовательность, обеспечивающая высокую аналитическую чувствительность. Однако IS481 встречается также у Bordetella holmesii — менее частого возбудителя коклюшеподобного синдрома — и в отдельных штаммах B. bronchiseptica, что обусловливает возможную перекрёстную реактивность и требует подтверждения более специфичными мишенями в сомнительных случаях. Для B. parapertussis используется инсерционная последовательность IS1001, для B. bronchiseptica — молекулярные маркёры промоторной области гена коклюшного токсина и других видоспецифичных локусов. Современные тест-системы используют комбинации мишеней, повышающие специфичность.

Отдельный технический аспект, существенно влияющий на корректность интерпретации, — риск контаминации пробы ДНК вакцинных штаммов. Современные ацеллюлярные коклюшные вакцины могут содержать ДНК B. pertussis, поддающуюся амплификации методом ПЦР. При неосторожной работе с пробами в помещениях, где производится или хранится вакцинный материал, возможно появление ложноположительных результатов. Чистота рабочих зон и разделение потоков забора/обработки проб и вакцинации — стандартные условия достоверности молекулярной диагностики коклюша.

Клиническое значение

Положительный результат ПЦР на B. pertussis у пациента с соответствующей клинической картиной — подтверждение диагноза коклюша. Клиническая интерпретация учитывает возраст пациента, длительность кашля, характер приступов, эпидемиологический анамнез (контакт с больным, вакцинальный статус, наличие подобной симптоматики в семье или коллективе). Подтверждение коклюшной этиологии определяет тактику ведения: раннее назначение макролидов (азитромицин как препарат выбора; альтернативы — кларитромицин, эритромицин, при непереносимости макролидов — триметоприм-сульфаметоксазол) с прицелом как на клинический эффект в катаральный и ранний пароксизмальный период, так и на ограничение передачи инфекции. Важное эпидемиологическое следствие положительного результата — необходимость химиопрофилактики макролидами для близких контактных лиц, в первую очередь новорождённых, беременных на поздних сроках и иммунокомпрометированных.

Положительный результат на B. parapertussis интерпретируется сходно, с двумя важными оговорками: коклюшная вакцинация не исключает паракоклюша, а клиническая картина у ряда пациентов мягче, чем при коклюше. Терапевтический подход аналогичен подходу к коклюшу, хотя клинический эффект макролидов при паракоклюше также зависит от срока начала лечения.

Положительный результат на B. bronchiseptica требует отдельной клинической оценки. У иммунокомпетентного пациента без контакта с животными такая находка нетипична и должна подвергаться критическому пересмотру, в том числе с учётом технической возможности перекрёстной реактивности коклюшной ПЦР-мишени IS481 в отдельных штаммах B. bronchiseptica. У пациентов из групп риска — при иммуносупрессии, тесном контакте с животными, соответствующей клинической картине — результат расценивается как указание на возможную оппортунистическую инфекцию и требует соответствующего терапевтического подхода, отличного от стандартной терапии коклюша (β-лактамы неэффективны, макролиды активны ограниченно).

Отрицательный результат снижает вероятность инфекции, но не исключает её полностью. Чувствительность ПЦР максимальна в первые 2–3 недели от начала симптомов и затем постепенно снижается по мере уменьшения бактериальной нагрузки. У пациентов, обращающихся в поздние сроки заболевания (более 3–4 недель от начала симптомов) или уже получавших антибактериальную терапию, отрицательный результат ПЦР не позволяет надёжно исключить коклюш; в этих ситуациях диагностика дополняется серологическими методами — определением антител класса IgG к коклюшному токсину.

Ограничения

Метод ПЦР определяет ДНК возбудителя без оценки его жизнеспособности. Чувствительность исследования зависит от срока выполнения: она максимальна в катаральный период и ранний пароксизмальный период и существенно снижается в поздних стадиях заболевания; отрицательный результат у пациента, обратившегося поздно, не исключает коклюш. Предшествующая антибактериальная терапия также снижает чувствительность молекулярной диагностики. Наиболее широко используемая мишень ПЦР на B. pertussis — IS481 — встречается также у B. holmesii и в отдельных штаммах B. bronchiseptica, что может приводить к перекрёстной реактивности; при клинической значимости видовой дифференциации результат подтверждается тест-системами с дополнительными специфическими мишенями. Современные ацеллюлярные коклюшные вакцины содержат ДНК B. pertussis, и контаминация пробы вакцинным материалом при несоблюдении правил пробоподготовки может давать ложноположительные результаты. Положительный результат на B. bronchiseptica у пациентов без соответствующей клинической картины, контакта с животными или иммуносупрессии требует критической оценки: этот возбудитель редко вызывает инфекцию у иммунокомпетентного человека. Тест не оценивает чувствительность возбудителей к антибактериальным препаратам и не заменяет клинической оценки тяжести заболевания. Результат требует интерпретации врачом — инфекционистом, педиатром или терапевтом — с учётом клинической картины, возраста пациента, длительности симптомов, вакцинального анамнеза и эпидемиологического окружения.