ПЦР-диагностика вируса гепатита B (HBV) в крови

Определение ДНК вируса гепатита B (Hepatitis B virus) в крови методом ПЦР, качественное исследование — молекулярно-биологический тест, выявляющий генетический материал вируса гепатита В в сыворотке или плазме крови. Вирус гепатита В — ДНК-содержащий вирус семейства Hepadnaviridae, передающийся парентеральным (через кровь и её компоненты, инвазивные медицинские манипуляции, инъекционное употребление наркотиков), половым и вертикальным (от матери ребёнку) путями. Гепатит В — одна из наиболее значимых инфекций в мире: по данным ВОЗ, хроническую инфекцию имеют около 250 миллионов человек, и она является ведущей причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы вирусной этиологии.

Течение гепатита В принципиально различается в зависимости от возраста инфицирования. У взрослых острая инфекция в большинстве случаев (более 95%) завершается самостоятельным выздоровлением с элиминацией вируса и формированием стойкого иммунитета. У новорождённых и детей раннего возраста ситуация противоположна: при перинатальном заражении хронизация развивается в 90% случаев, при заражении в возрасте 1–5 лет — в 20–50%. Хронический гепатит В может протекать десятилетиями бессимптомно, постепенно приводя к фиброзу, циррозу и гепатоцеллюлярной карциноме. Именно поэтому ранняя диагностика и мониторинг активности вируса имеют критическое значение.

ДНК вируса гепатита В появляется в крови уже через 3–4 недели после инфицирования — на 2–3 недели раньше, чем HBsAg, и значительно раньше, чем антитела. Виремия при острой инфекции нарастает к моменту максимального повышения печёночных ферментов и при благоприятном исходе постепенно снижается до неопределяемых значений по мере иммунного клиренса. При хронической инфекции ДНК вируса сохраняется в крови на различных уровнях — от высокой вирусной нагрузки при активной репликации до низких или неопределяемых значений при неактивном носительстве. Однако даже после серологического «выздоровления» (исчезновение HBsAg, появление anti-HBs) вирус не элиминируется полностью: ковалентно замкнутая кольцевая ДНК (cccDNA) сохраняется в гепатоцитах пожизненно, что объясняет возможность реактивации при иммуносупрессии.

Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) обнаруживает непосредственно ДНК вируса в крови — прямое свидетельство присутствия возбудителя. Качественное исследование отвечает на вопрос «есть ли вирус в крови» (результат: обнаружено / не обнаружено), не определяя его количество. ПЦР обладает высокой аналитической чувствительностью и способна выявить вирус при вирусной нагрузке ниже порога серологических методов.

Клиническое значение

Диагностика гепатита В строится на комплексе серологических маркёров (HBsAg, anti-HBs, anti-HBc IgM и IgG, HBeAg, anti-HBe) и молекулярных методов (ДНК HBV). Ни один из этих маркёров в отдельности не позволяет полностью охарактеризовать стадию и активность инфекции — диагноз формируется по их совокупности. Качественное определение ДНК вируса гепатита В методом ПЦР занимает в этой системе определённые клинические ниши.

Диагностика ранней острой инфекции в «серологическом окне». ДНК HBV появляется в крови примерно за 3 недели до HBsAg. В период между началом виремии и появлением HBsAg серологические методы дают отрицательный результат, и ПЦР остаётся единственным способом подтвердить инфекцию. Это особенно значимо в ситуациях, когда у пациента с клинической картиной острого гепатита (повышение аминотрансфераз, желтуха) HBsAg ещё не определяется, а маркёры других гепатитов отрицательны.

Выявление оккультного гепатита В (occult HBV infection). Оккультный гепатит В — состояние, при котором HBsAg в крови не определяется, однако ДНК вируса присутствует (как правило, на низком уровне). Anti-HBc IgG при этом обычно положительны, anti-HBs могут быть как положительными, так и отрицательными. Оккультный гепатит В клинически значим в нескольких ситуациях: при назначении иммуносупрессивной терапии (ритуксимаб, другие анти-CD20-препараты, высокодозные глюкокортикостероиды, химиотерапия) существует риск реактивации вируса с развитием тяжёлого, иногда фульминантного гепатита; при обследовании доноров крови и органов — для предотвращения трансфузионной или трансплантационной передачи; при обследовании беременных — для оценки риска вертикальной передачи; при криптогенном циррозе и гепатоцеллюлярной карциноме, когда стандартные серологические маркёры отрицательны, а ПЦР выявляет скрытую инфекцию.

Дифференциальная диагностика острого гепатита неясной этиологии. При клинической картине острого поражения печени, когда серологический профиль неоднозначен (сомнительный HBsAg, отрицательные маркёры других гепатитов), обнаружение или необнаружение ДНК HBV помогает установить или исключить этиологию.

Подтверждение активной репликации при хроническом гепатите В. При хронической инфекции качественное определение ДНК даёт ответ на вопрос, происходит ли репликация вируса. Однако для клинического ведения хронического гепатита В (определение фазы инфекции, показаний к терапии, мониторинг эффективности лечения) качественного исследования, как правило, недостаточно — необходимо количественное определение ДНК HBV с оценкой вирусной нагрузки в МЕ/мл. Качественный тест может использоваться как первичный скрининговый шаг перед количественным исследованием.

Обследование перед назначением иммуносупрессивной терапии. Перед началом терапии ритуксимабом, другими биологическими препаратами, высокодозными глюкокортикостероидами, химиотерапией рекомендуется определение ДНК HBV даже при отрицательном HBsAg (при положительном anti-HBc) — для выявления оккультной инфекции и оценки необходимости профилактической противовирусной терапии. Реактивация гепатита В на фоне иммуносупрессии может протекать молниеносно и завершиться печёночной недостаточностью.

Обследование новорождённых от HBsAg-положительных матерей. Для оценки эффективности иммунопрофилактики (вакцина + иммуноглобулин) определение ДНК HBV может дополнять серологическое тестирование в первые месяцы жизни, когда интерпретация серологических маркёров осложнена пассивным переносом материнских антител.

Контроль безопасности донорской крови. ПЦР-тестирование донорских пулов на ДНК HBV — стандартная мера безопасности в службе крови, позволяющая выявить инфекцию в период серологического окна и при оккультном гепатите В.

В отличие от серологических тестов, ПЦР не зависит от иммунного ответа пациента: она обнаруживает вирус, а не антитела. Это делает метод информативным у иммунокомпрометированных пациентов, у новорождённых и в ранние сроки инфекции, когда иммунный ответ ещё не сформирован.

Ограничения

Качественный тест отвечает на вопрос «есть ли вирус», но не определяет вирусную нагрузку. Для принятия решений о противовирусной терапии, определения фазы хронической инфекции (иммунотолерантная, иммуноактивная, неактивное носительство, HBeAg-негативный гепатит), мониторинга эффективности лечения и оценки риска прогрессирования необходимо количественное определение ДНК HBV. Качественный результат «обнаружено» не позволяет различить активную репликацию с высокой вирусной нагрузкой и низкоуровневую виремию неактивного носительства. 
Отрицательный результат не исключает инфекцию. ДНК вируса может не определяться при очень низкой вирусной нагрузке (ниже аналитической чувствительности метода), в ранний инкубационный период (до начала виремии), при спонтанном или терапевтическом подавлении репликации. cccDNA сохраняется в гепатоцитах даже при неопределяемой виремии, и вирус может реактивироваться при иммуносупрессии. 
ПЦР не заменяет серологическую диагностику. Серологические маркёры (HBsAg, anti-HBs, anti-HBc, HBeAg, anti-HBe) необходимы для определения стадии инфекции, иммунного статуса, показаний к лечению. ПЦР дополняет серологию, но не подменяет её. 
Обнаружение ДНК HBV указывает на присутствие вируса и требует интерпретации вместе с серологическими маркёрами, биохимическими показателями функции печени и клиническим контекстом.