ПЦР-диагностика вируса Эпштейна-Барр в крови, количественное исследование

Кровь для количественной ПЦР ВЭБ — это клинически значимый материал (цельная кровь), так как она содержит и клетки (где вирус преимущественно находится), и плазму. В отличие от сыворотки, это основной или один из основных рекомендуемых биоматериалов для мониторинга. Исследование направлено на количественное определение ДНК вируса Эпштейна-Барр в крови. Тест показывает, сколько вируса находится в крови в данный момент, и по изменению этого числа со временем можно судить, активна ли инфекция, усиливается она или затихает, помогает ли лечение. 
Количественная ПЦР применяется прежде всего для наблюдения за пациентами с ослабленным иммунитетом — людьми, которые перенесли пересадку органов или костного мозга, живут с ВИЧ-инфекцией или получают лечение онкогематологических заболеваний. У таких пациентов иммунная система не может удерживать вирус в неактивном состоянии, он начинает размножаться и способен вызвать серьёзные осложнения. Регулярное измерение количества вируса в крови позволяет заметить нарастание активности на ранней стадии, оценить ответ на терапию и вовремя скорректировать лечение. Анализы на антитела к вирусу (IgM и IgG к VCA, EA, EBNA) показывают лишь факт контакта с инфекцией в прошлом и стадию иммунного ответа, но не отражают, насколько активно вирус размножается сейчас.

Кровь — один из основных биоматериалов для мониторинга вируса Эпштейна-Барр. Вирус в крови находится преимущественно внутри инфицированных B-лимфоцитов, и цельная кровь, содержащая и клетки, и жидкую фракцию, наиболее полно отражает общее количество вируса в кровотоке. Именно цельная кровь и плазма — два наиболее информативных биоматериала, применяемых в международной клинической практике для этой задачи.

Вирус Эпштейна-Барр (EBV, HHV-4) — гамма-герпесвирус, широко распространённый в человеческой популяции. К 18–25 годам доля людей с антителами к вирусу в крови достигает 90–95%. При первичном заражении вирус реплицируется в эпителии ротоглотки и слюнных желёз, затем инфицирует B-лимфоциты, в которых устанавливает пожизненную латентную инфекцию. У здоровых людей эту инфекцию контролируют T-лимфоциты, и клинически значимого размножения вируса не происходит. При нарушении T-клеточного иммунитета — после трансплантации органов или костного мозга, при ВИЧ-инфекции, на фоне биологической терапии — контроль ослабевает, заражённые B-клетки начинают активно делиться, и количество вирусной ДНК в крови нарастает. Именно эта связь между уровнем вируса и состоянием иммунитета лежит в основе клинического использования количественной ПЦР.

Клиническое значение

Наибольшее клиническое применение количественная ПЦР на ВЭБ нашла у реципиентов трансплантатов. Тяжёлое осложнение трансплантации, при котором этот анализ служит одним из главных инструментов наблюдения, — посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD). Клинический спектр PTLD широк: у одних пациентов процесс проявляется мягко — избыточным разрастанием лимфоидной ткани, у других принимает форму агрессивной лимфомы.

Связь PTLD с вирусом Эпштейна-Барр неодинакова в разных группах. У детей и при ранних формах, возникающих вскоре после трансплантации, вирус обнаруживается почти всегда. У взрослых и при поздних, так называемых мономорфных формах связь слабее: по данным обзоров, от 10 до почти половины случаев PTLD оказываются ВЭБ-негативными. В таких случаях количественная ПЦР не работает как ранний сигнал тревоги — вирусная нагрузка может оставаться низкой, пока болезнь уже развивается, и врач оценивает ситуацию в совокупности с клинической картиной и другими исследованиями.

Смертность при PTLD высока, но ранняя диагностика существенно меняет прогноз. При ВЭБ-ассоциированных формах нарастание вирусной нагрузки нередко происходит ещё до появления симптомов болезни, и у врача появляется время действовать на упреждение — уменьшить дозу иммуноподавляющих препаратов или начать терапию. После постановки диагноза количественная ПЦР используется для оценки ответа на лечение: если препараты работают, нагрузка снижается; если нет — это повод пересмотреть тактику. В арсенале лечения — снижение иммуносупрессии, ритуксимаб, химиотерапия, а в отдельных случаях — клеточная терапия T-лимфоцитами, специально подготовленными против ВЭБ.

Международные рекомендации по наблюдению за ВЭБ у пациентов после пересадки костного мозга допускают использование разных биоматериалов — цельной крови, плазмы и сыворотки — без формального предпочтения одного другому. Главное требование — последовательность: каждый следующий анализ должен быть выполнен на том же материале, что и предыдущий. Смена материала в ходе наблюдения делает сравнение результатов ненадёжным, и динамика становится неинформативной.

Инфекционный мононуклеоз — классическое проявление первичной инфекции ВЭБ у подростков и молодых взрослых, с лихорадкой, болью в горле, увеличенными лимфоузлами и общей слабостью. При типичном течении диагноз ставится клинически, дополняется общим анализом крови (в нём обнаруживают характерные атипичные мононуклеары) и серологией. Количественная ПЦР в крови может быть информативна при тяжёлом, затяжном или нетипичном течении, а также при хронической активной ВЭБ-инфекции — редком состоянии, когда симптомы, похожие на мононуклеоз, сохраняются месяцами, а уровень вируса высок и создаёт риск развития лимфом и тяжёлого синдрома гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза.

Гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, ассоциированный с ВЭБ, — жизнеугрожающее состояние, при котором иммунная система начинает атаковать собственные клетки крови. Проявляется высокой лихорадкой, увеличением селезёнки, снижением количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, повышением уровня триглицеридов и ферритина. Высокая вирусная нагрузка ВЭБ в крови поддерживает диагноз и служит ориентиром при оценке ответа на терапию.

У пациентов с онкологическими заболеваниями, связанными с ВЭБ, количественная ПЦР применяется как косвенный маркер опухолевого процесса. К таким заболеваниям относятся лимфома Беркитта, часть B-клеточных и T/NK-клеточных лимфом, назофарингеальная карцинома и некоторые другие. При назофарингеальной карциноме — опухоли носоглотки — вирусная ДНК в крови является признанным маркером прогноза и мониторинга: её уровень коррелирует со стадией заболевания и с эффективностью лечения. Сам диагноз онкологического заболевания ставится по результатам биопсии и гистологического исследования ткани опухоли; количественная ПЦР не заменяет биопсию, а служит дополнительным инструментом на этапе наблюдения.

У пациентов с ВИЧ-инфекцией количественная ПЦР на ВЭБ может быть полезна при подозрении на ассоциированные лимфомы — лимфому Ходжкина, B-клеточные неходжкинские лимфомы, первичную лимфому центральной нервной системы. Для последней основным материалом является не кровь, а спинномозговая жидкость: именно в ликворе вирусная ДНК обнаруживается при поражении мозга и оболочек.

Рутинное обследование здоровых людей на количество ВЭБ в крови не показано. У тех, кто когда-либо переболел инфекцией (а это большинство взрослого населения), вирус остаётся в организме пожизненно, но находится под контролем иммунитета, и в крови его либо нет, либо он определяется в следовых количествах, не требующих действий.

Ограничения метода

Клиническое значение имеют изменения вирусной нагрузки у одного и того же пациента в динамике, а не сравнение отдельного результата с «нормой»: общепринятых пороговых значений, запускающих терапевтические действия, для ВЭБ не установлено — они различаются по типу трансплантата и протоколу центра. Смена материала (цельная кровь, плазма, сыворотка) или смена лаборатории в ходе наблюдения делает сравнение результатов ненадёжным. 
Результат отражает вирусную нагрузку в крови в момент забора и не характеризует другие анатомические области — ликвор, ткань опухоли, ротоглотку, костный мозг. Положительный результат с высокой нагрузкой требует клинической интерпретации: он поддерживает диагноз ВЭБ-ассоциированного процесса, но сам по себе не устанавливает его. PTLD, лимфомы и гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз подтверждаются гистологическим исследованием и клинической картиной. Отрицательный результат не полностью исключает ВЭБ-ассоциированное заболевание: при ВЭБ-негативных формах PTLD и при некоторых лимфомах вирусная нагрузка в крови может быть неопределяемой независимо от активности заболевания. 
Приём противовирусных препаратов (ганцикловир, ацикловир) и иммунотерапия (ритуксимаб, ВЭБ-специфические цитотоксические T-лимфоциты) влияют на количество вирусной ДНК в крови. Интерпретация результата на фоне терапии требует учёта времени забора относительно введения препаратов. 
Заключение формулирует лечащий врач (инфекционист, гематолог, онколог, трансплантолог, педиатр) с учётом клинической картины, серологического статуса, данных гистологического исследования (при наличии биопсии), визуализации, результатов дополнительных исследований и динамики вирусной нагрузки.