ПЦР-диагностика пневмоциста (Pneumocystis jirovecii) в мокроте

Анализ выявляет ДНК Pneumocystis jirovecii (ранее известного как Pneumocystis carinii) в мокроте методом ПЦР. Результат выдаётся в формате обнаружено / не обнаружено. Исследование направлено на диагностику пневмоцистной пневмонии — оппортунистической инфекции, развивающейся у пациентов с нарушениями клеточного иммунитета. Биоматериал — мокрота, спонтанная или индуцированная, получаемая при откашливании; при невозможности получения мокроты и в сложных диагностических ситуациях клинически более чувствительным биоматериалом для молекулярной диагностики пневмоцистной инфекции служит бронхоальвеолярный лаваж, получаемый при бронхоскопии.

Pneumocystis jirovecii — атипичный грибковый возбудитель, длительное время относимый к простейшим и классифицированный как гриб лишь после молекулярно-генетического анализа. Название Pneumocystis jirovecii было закреплено за человеческим видом в 2002 году; ранее использовавшееся название Pneumocystis carinii сегодня относится к виду, поражающему крыс, однако по инерции всё ещё встречается в клинической литературе применительно к человеческой инфекции. Биологически возбудитель существенно отличается от типичных грибов: не растёт на стандартных микологических средах, не синтезирует эргостерол — основу клеточной мембраны большинства грибов, — и поэтому не реагирует на большинство противогрибковых препаратов. Терапия пневмоцистной пневмонии строится на специфических препаратах, отличающихся от стандартных антимикотиков. 
Клиническая значимость Pneumocystis jirovecii у человека практически полностью сосредоточена в одной нозологической форме — пневмоцистной пневмонии. Это классическая оппортунистическая инфекция, развивающаяся у пациентов с нарушениями клеточного иммунитета и не вызывающая заболевания у иммунокомпетентных людей. Основные группы риска: пациенты с ВИЧ-инфекцией при глубоком снижении CD4+ лимфоцитов (особенно ниже 200 клеток/мкл) — у них пневмоцистная пневмония остаётся одной из наиболее распространённых оппортунистических инфекций и СПИД-индикаторным заболеванием; пациенты после трансплантации органов и костного мозга; пациенты на длительной терапии системными глюкокортикоидами в высоких дозах; пациенты, получающие цитостатики и биологические препараты — прежде всего анти-CD20 моноклональные антитела; пациенты с первичными иммунодефицитами. 
Клиническая картина пневмоцистной пневмонии различается у пациентов с ВИЧ и у пациентов без ВИЧ. У ВИЧ-инфицированных инфекция обычно развивается подостро — в течение нескольких недель: постепенно нарастающая одышка, сухой непродуктивный кашель, субфебрильная лихорадка, выраженная гипоксемия при относительно скудной аускультативной картине лёгких. У пациентов без ВИЧ, прежде всего после трансплантации и на интенсивной иммуносупрессии, течение обычно более острое и тяжёлое, с быстрым развитием дыхательной недостаточности. Рентгенологическая картина — двусторонние интерстициальные инфильтраты, центральные или перихилярные; на компьютерной томографии грудной клетки типично выявляются зоны «матового стекла», чаще симметричные. Уровень β-D-глюкана в сыворотке обычно повышен и служит дополнительным биомаркером инфекции.

Диагностика пневмоцистной пневмонии традиционно строилась на микроскопическом исследовании биоматериала из дыхательных путей с применением специальных окрасок (Gomori methenamine silver, Giemsa) и иммунофлюоресцентных методов, выявляющих цисты и трофозоиты возбудителя. Микроскопия бронхоальвеолярного лаважа — исторически референсный метод, однако её чувствительность существенно зависит от количества возбудителя в материале, и у пациентов без ВИЧ, у которых бактериальная нагрузка обычно значительно ниже, чем у ВИЧ-инфицированных, микроскопия часто даёт ложноотрицательный результат. Молекулярные методы — существенно более чувствительны и стали важным инструментом этиологической диагностики, особенно у пациентов без ВИЧ и при исследовании биоматериалов с ожидаемо низкой бактериальной нагрузкой.

ПЦР выявляет специфические участки генома Pneumocystis jirovecii — чаще всего консервативные последовательности митохондриальной большой субъединицы рибосомальной РНК — и обеспечивает прямое обнаружение возбудителя в биоматериале. Метод не зависит от жизнеспособности возбудителя, обладает высокой аналитической чувствительностью и способен выявлять инфекцию даже при низкой грибковой нагрузке, что принципиально важно для диагностики у пациентов без ВИЧ.

Клиническое значение

Основной клинический сценарий применения исследования — диагностика пневмоцистной пневмонии у пациентов с клинической картиной подозрительной на неё и с известными факторами риска оппортунистической инфекции: у пациентов с ВИЧ-инфекцией при низком уровне CD4+ лимфоцитов, у реципиентов трансплантатов, у пациентов на интенсивной иммуносупрессивной терапии, у пациентов с первичными иммунодефицитами. Типичная клиническая картина — нарастающая одышка, сухой кашель, гипоксемия, двусторонние интерстициальные изменения на рентгенограмме у пациента из группы риска — служит основанием для целенаправленного этиологического обследования.

Мокрота как биоматериал клинически применима в первую очередь у пациентов, способных её продуктивно отделять, и при отсутствии технических возможностей получения бронхоальвеолярного лаважа. Поскольку при пневмоцистной пневмонии кашель обычно непродуктивный, получение адекватного объёма спонтанной мокроты часто затруднено, и более информативной альтернативой служит индуцированная мокрота, собираемая после ингаляции гипертонического раствора. У пациентов без удовлетворительного результата исследования мокроты, с сохраняющимся клиническим подозрением на пневмоцистную пневмонию, диагностика продолжается исследованием бронхоальвеолярного лаважа как более чувствительного биоматериала.

Положительный результат у пациента с соответствующей клинической картиной и известными факторами риска служит этиологическим подтверждением пневмоцистной пневмонии и основанием для незамедлительного начала специфической терапии. Своевременное начало лечения принципиально важно для прогноза, особенно у пациентов с тяжёлой дыхательной недостаточностью. Важно отметить, что высокая аналитическая чувствительность ПЦР может приводить к выявлению возбудителя при клинически незначимой колонизации дыхательных путей у пациентов, не имеющих активной пневмонии; в таких ситуациях положительный результат интерпретируется совместно с клинической картиной, рентгенологическими данными и дополнительными биомаркерами — уровнем β-D-глюкана в сыворотке, количественной оценкой грибковой нагрузки при её выполнении.

Отрицательный результат при исследовании мокроты снижает вероятность пневмоцистной пневмонии, но должен интерпретироваться с учётом меньшей чувствительности мокроты по сравнению с бронхоальвеолярным лаважем. У пациента с клинической картиной, высоко подозрительной на пневмоцистную пневмонию, и отрицательным результатом ПЦР мокроты обследование продолжается исследованием бронхоальвеолярного лаважа и оценкой β-D-глюкана в сыворотке.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности и о клинической активности инфекции. Высокая аналитическая чувствительность теста может приводить к выявлению Pneumocystis jirovecii при клинически незначимой колонизации дыхательных путей, особенно у пациентов с другими причинами респираторной симптоматики; интерпретация положительного результата требует сопоставления с клинической картиной, рентгенологическими данными и, при доступности, с количественной оценкой грибковой нагрузки и уровнем β-D-глюкана в сыворотке. Мокрота уступает по клинической чувствительности бронхоальвеолярному лаважу, рассматриваемому как референсный биоматериал для молекулярной диагностики пневмоцистной инфекции: при сохраняющемся клиническом подозрении после отрицательного результата исследования мокроты диагностика продолжается исследованием бронхоальвеолярного лаважа. Индуцированная мокрота клинически более информативна, чем спонтанная, у пациентов со слабо продуктивным кашлем. На чувствительность метода влияет предшествующая специфическая терапия пневмоцистной инфекции, снижающая количество возбудителя в пробе. ПЦР не определяет чувствительность Pneumocystis jirovecii к противогрибковым и специфическим препаратам; оценка чувствительности в рутинной клинической практике не проводится в силу особенностей биологии возбудителя. Результат исследования требует интерпретации врачом — пульмонологом, инфекционистом, специалистом по ВИЧ-инфекции, трансплантологом — с учётом клинической картины, иммунного статуса пациента, рентгенологических данных, результатов сопутствующих исследований и общей клинической ситуации.