ПЦР-диагностика микоплазмы (Mycoplasma pneumoniae) в слюне

Анализ выявляет ДНК Mycoplasma pneumoniae в слюне методом ПЦР. Результат выдаётся в формате обнаружено / не обнаружено. Исследование направлено на этиологическую диагностику микоплазменной инфекции — одной из частых причин атипичной пневмонии и ряда других форм поражения дыхательных путей, особенно у детей школьного возраста и молодых взрослых. Слюна не относится к референсным биоматериалам для молекулярной диагностики M. pneumoniae: международные рекомендации указывают в качестве предпочтительных назофарингеальный мазок, ротоглоточный мазок, при продуктивном кашле — мокроту, а в специфических клинических ситуациях — бронхоальвеолярный лаваж. В слюне M. pneumoniae может присутствовать в меньших концентрациях, чем в материале, забранном непосредственно со слизистой дыхательных путей; клиническая чувствительность исследования слюны при микоплазменной инфекции по данным отдельных работ вариабельна. Это исследование применяется в клинических ситуациях, в которых получение стандартного биоматериала затруднено или когда слюна выбирается как дополнительный материал в комплексной оценке.

M. pneumoniae относится к классу Mollicutes — микроорганизмам, лишённым клеточной стенки. Возбудитель имеет характерную способность прикрепляться к реснитчатому эпителию дыхательных путей с помощью специализированной адгезивной органеллы, в которой ключевую роль играет белок P1 — основная антигенная мишень иммунного ответа. Отсутствие клеточной стенки определяет природную устойчивость M. pneumoniae ко всем β-лактамным антибиотикам; клинически активными остаются препараты, действующие на внутриклеточный синтез, — прежде всего макролиды, а также тетрациклины и фторхинолоны у взрослых. Эпидемиологически M. pneumoniae передаётся воздушно-капельным путём, инкубационный период относительно длительный — две-три недели, что отличает её от многих других респираторных инфекций. Характерна эпидемическая цикличность с подъёмами заболеваемости каждые три-семь лет и накладывающимися сезонными колебаниями.

Клинические формы микоплазменной инфекции разнообразны. Наиболее распространённая — инфекции верхних дыхательных путей: фарингит, трахеобронхит, часто протекающие как самоограничивающееся заболевание без специфической терапии, особенно у детей. Более клинически значимая форма — микоплазменная пневмония, одна из основных причин внебольничной пневмонии у школьников и молодых взрослых. Её классическое клиническое течение даёт основания для обозначения «атипичная пневмония» и отличается от типичной бактериальной пневмонии постепенным началом, длительным субфебрилитетом, мучительным сухим непродуктивным кашлем, головной болью и миалгией при относительно сохранном общем состоянии — отсюда известный клинический термин «ходячая пневмония» (walking pneumonia). Рентгенологическая картина нередко не соответствует клинической выраженности: при умеренной клинической симптоматике могут выявляться достаточно распространённые интерстициальные и очаговые изменения. У части пациентов заболевание протекает тяжелее, с выраженной клинической симптоматикой, дыхательной недостаточностью. 
Отдельная клинически значимая особенность микоплазменной инфекции — внереспираторные проявления, возникающие у меньшинства инфицированных, но имеющие существенное клиническое значение. К ним относятся кожно-слизистые реакции — от эритематозных сыпей до тяжёлых форм вплоть до синдрома Стивенса-Джонсона и специфического синдрома Mycoplasma-induced rash and mucositis (MIRM); неврологические проявления — энцефалит, менингит, синдром Гийена-Барре; гематологические — аутоиммунная гемолитическая анемия, связанная с холодовыми антителами; кардиальные — миокардит, перикардит; суставные проявления. M. pneumoniae также рассматривается как триггер обострений бронхиальной астмы. 
Диагностика микоплазменной инфекции в современной клинической практике строится преимущественно на молекулярных методах. ПЦР обеспечивает высокую чувствительность и быстрый ответ в острую фазу заболевания, особенно в первые две недели от начала клинической симптоматики, когда возбудитель активно размножается на слизистой дыхательных путей. Серологические методы — определение IgM и IgG антител к M. pneumoniae — дополняют молекулярную диагностику: IgM обычно появляются через одну-две недели от начала заболевания, что делает их менее информативными в раннюю фазу; у взрослых и при повторных инфекциях IgM-ответ может быть отсутствующим или слабым. Референсный серологический подход — выявление четырёхкратного подъёма титра IgG в парных сыворотках, однако это требует длительного наблюдения и применяется в основном для ретроспективного подтверждения. Культуральное исследование M. pneumoniae затруднено в силу крайне медленного роста возбудителя (недели) и требует специализированных сред, в рутинной клинической практике выполняется редко.

ПЦР выявляет специфические участки генома M. pneumoniae (обычно участок гена P1 или консервативные последовательности рибосомальных генов) и обеспечивает прямое обнаружение возбудителя в биоматериале. Метод не зависит от жизнеспособности микроорганизма и сохраняет чувствительность при ранней антибактериальной терапии.

Специфика слюны как биоматериала при диагностике M. pneumoniae связана с тем, что возбудитель локализуется на поверхности реснитчатого эпителия дыхательных путей, и слюна содержит его в меньших концентрациях, чем материал, полученный непосредственно со слизистой. Клинические исследования, оценивающие информативность слюны при молекулярной диагностике микоплазменной инфекции, показывают вариабельные результаты: в ряде работ слюна демонстрирует приемлемую чувствительность и может служить неинвазивной альтернативой назофарингеальному мазку у детей и у пациентов, у которых получение стандартного биоматериала затруднено, однако эти данные пока не привели к включению слюны в число референсных биоматериалов в международных рекомендациях. Это обстоятельство определяет характер клинического использования исследования.

Клиническое значение

Исследование применяется в клинических ситуациях, в которых обоснована этиологическая диагностика микоплазменной инфекции. Типичный клинический сценарий — пациент с клинической картиной внебольничной атипичной пневмонии, длительного сухого кашля, бронхита с постепенным началом, особенно у ребёнка школьного возраста или молодого взрослого, в эпидемический период микоплазменной инфекции. Ранняя этиологическая верификация позволяет своевременно назначить адекватную антибактериальную терапию, поскольку микоплазменная инфекция не чувствительна к β-лактамным антибиотикам, часто назначаемым эмпирически при внебольничных респираторных инфекциях.

Отдельный клинически значимый сценарий — обследование пациентов с внереспираторными проявлениями, подозрительными на микоплазменный генез: кожно-слизистыми реакциями, неврологической симптоматикой, признаками миокардита, гемолитической анемии. В этих клинических ситуациях этиологическое подтверждение инфекции M. pneumoniae имеет прямое клиническое значение для выбора тактики ведения.

Третий сценарий — обследование пациентов с длительным кашлем неясной этиологии, у которых в рамках дифференциальной диагностики рассматривается микоплазменная инфекция наряду с другими возбудителями — коклюшем, инфекциями Chlamydia pneumoniae, вирусными инфекциями.

Применение слюны как биоматериала в указанных клинических сценариях рассматривается прежде всего в ситуациях, когда получение стандартного биоматериала технически затруднено или нежелательно — в педиатрической практике у детей младшего возраста, при обследовании на дому, в эпидемиологических обследованиях, а также в качестве дополнительного биоматериала в рамках комплексного подхода.

Положительный результат у пациента с соответствующей клинической картиной служит этиологическим подтверждением микоплазменной инфекции и основанием для назначения этиотропной антибактериальной терапии препаратами группы макролидов, а у взрослых при клинической необходимости — тетрациклинов или фторхинолонов. При наличии у пациента клинических признаков макролидрезистентной инфекции — отсутствия клинического улучшения через два-три дня макролидной терапии, сохранения лихорадки — рассматривается переход на альтернативные группы препаратов, активные в отношении макролидрезистентных штаммов. Молекулярное тестирование на мутации устойчивости в гене 23S рибосомальной РНК M. pneumoniae выполняется отдельным исследованием при клинической необходимости.

Отрицательный результат снижает вероятность участия M. pneumoniae в клинической картине, однако интерпретируется с учётом особенностей биоматериала и сроков обследования. При отрицательном результате исследования слюны у пациента с клинической картиной, подозрительной на микоплазменную инфекцию, особенно в ситуациях, где слюна применялась как альтернативный биоматериал, обследование может быть дополнено исследованием назофарингеального или ротоглоточного мазка, а при позднем обращении — серологическим исследованием.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Слюна не относится к референсным биоматериалам для молекулярной диагностики M. pneumoniae: референсными биоматериалами служат назофарингеальный мазок и ротоглоточный мазок, а при продуктивном кашле — мокрота, обеспечивающие более высокую клиническую чувствительность исследования. Слюна может применяться как неинвазивная альтернатива в ситуациях, когда получение стандартного биоматериала затруднено, однако при отрицательном результате на слюне у пациента с высоким клиническим подозрением обследование целесообразно дополнить исследованием материала, забранного непосредственно со слизистой дыхательных путей. Чувствительность метода имеет зависимость от сроков заболевания: максимальна в первые две недели от начала клинической симптоматики, снижается на поздних сроках; у пациентов, обследованных поздно, отрицательный результат ПЦР не исключает микоплазменную инфекцию, и диагностика дополняется серологическим исследованием. На чувствительность метода влияет предшествующая антибактериальная терапия препаратами групп, активных в отношении M. pneumoniae, — макролидами, тетрациклинами, фторхинолонами, — снижающая количество возбудителя в пробе. ПЦР не определяет чувствительность M. pneumoniae к антибактериальным препаратам и не выявляет мутации устойчивости к макролидам — клинически значимый параметр в регионах с высокой распространённостью макролидрезистентных штаммов; для его оценки выполняется отдельное молекулярное исследование мутаций в 23S рибосомальной РНК. Другие возбудители атипичных пневмоний и респираторных инфекций — Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, респираторные вирусы — данным исследованием не детектируются и при клинической необходимости их диагностики выполняются отдельные исследования. Результат исследования требует интерпретации врачом — пульмонологом, инфекционистом, педиатром, терапевтом — с учётом клинической картины, сроков заболевания, эпидемиологического анамнеза, рентгенологических данных при их наличии, результатов серологического обследования и общей клинической ситуации.