ПЦР-диагностика микобактерий туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) в ликворе

Анализ выявляет ДНК микобактерий туберкулёза (Mycobacterium tuberculosis complex) в спинномозговой жидкости методом ПЦР. Результат выдаётся в формате обнаружено / не обнаружено.  Исследование применяется для этиологической диагностики туберкулёзного менингита — наиболее тяжёлой формы туберкулёза, связанной с высокой летальностью и инвалидизацией. Современные руководящие документы позиционируют молекулярное тестирование ликвора как рекомендованный первичный диагностический тест при клиническом подозрении на туберкулёзный менингит. Параллельно выполняются микроскопия на кислотоустойчивые бактерии и посев на жидких и плотных средах; посев сохраняет статус референсного метода, поскольку подтверждает жизнеспособность возбудителя и позволяет определить чувствительность к полному спектру противотуберкулёзных препаратов.

Туберкулёзный менингит развивается гематогенно — при прорыве гранулёмы или небольшого очага в мозговых оболочках на фоне диссеминации возбудителя из первичного очага, чаще лёгочного. У детей раннего возраста менингит может быть первой манифестацией туберкулёзной инфекции; у взрослых чаще развивается как осложнение реактивации латентной инфекции, особенно на фоне снижения клеточного иммунитета — при ВИЧ-инфекции, иммуносупрессивной терапии, выраженном истощении. Характерный патоморфологический признак — базальный менингит с преимущественным поражением основания мозга, часто с вовлечением черепных нервов и развитием обструктивной гидроцефалии. 
Клиническая картина туберкулёзного менингита принципиально отличается от острого бактериального. Начало подострое, симптомы нарастают в течение 1–3 недель. Ранняя стадия — неспецифические проявления: субфебрильная лихорадка, головная боль, общее недомогание, изменения настроения, постепенное снижение активности. По мере прогрессирования присоединяются умеренно выраженные менингеальные симптомы, рвота, нарушения сознания, очаговая неврологическая симптоматика — чаще всего поражение VI пары черепных нервов с диплопией, а также глазодвигательных нервов; развиваются эпилептические приступы, гидроцефалия с соответствующими проявлениями внутричерепной гипертензии. У пациентов с ВИЧ-инфекцией клиническая картина нередко атипична, менингеальные симптомы могут быть стёртыми, что затрудняет диагностику. 
Типичные изменения ликвора при туберкулёзном менингите — лимфоцитарный плеоцитоз (хотя в первые дни болезни могут преобладать нейтрофилы), повышение содержания белка, снижение глюкозы по отношению к сыворотке, нередко повышение уровня лактата. Эти изменения неспецифичны, но в сочетании с клинической картиной и данными визуализации (базальные изменения на МРТ, гидроцефалия, туберкулёмы) формируют клинические критерии вероятного туберкулёзного менингита.

Возбудителя в спинномозговой жидкости при туберкулёзном менингите крайне мало — в отличие, например, от лёгочного туберкулёза, где в мокроте бактерий обычно много. Низкая концентрация возбудителя в ликворе ограничивает возможности всех прямых методов его выявления, включая ПЦР: отрицательный результат исследования — любого из доступных методов — не позволяет надёжно исключить туберкулёзный менингит при сохраняющемся клиническом подозрении. 
Существенным фактором, влияющим на чувствительность исследования, является объём ликвора, направляемого на анализ. Клинические исследования показывают, что при объёме 6 мл и более вероятность лабораторного подтверждения возбудителя существенно выше, чем при меньших объёмах. Поэтому при клиническом подозрении на туберкулёзный менингит рекомендуется забор максимально возможного клинически допустимого объёма ликвора для оптимизации диагностической чувствительности.

ПЦР выявляет специфические участки генома Mycobacterium tuberculosis complex — чаще всего фрагмент инсерционной последовательности IS6110 или ген rpoB — и обладает высокой аналитической специфичностью. Метод детектирует ДНК, а не жизнеспособные бактерии, что имеет значение для интерпретации результата: положительный результат указывает на присутствие возбудителя в пробе, но не даёт информации об активности размножения и не исключает наличия ДНК, сохраняющейся после перенесённой инфекции.

Клиническое значение

Исследование применяется у пациентов с клиническим подозрением на туберкулёзный менингит — при подостро развивающейся неврологической симптоматике с признаками менингита и соответствующими изменениями ликвора, особенно у пациентов из групп высокого риска (ВИЧ-инфекция, иммуносупрессивная терапия, контакт с больным туберкулёзом, анамнез перенесённого туберкулёза, проживание в регионах с высокой заболеваемостью туберкулёзом, к которым относятся Россия и ряд сопредельных стран). Обследование входит в стандартный диагностический комплекс наряду с микроскопией ликвора на кислотоустойчивые бактерии, посевом на среды для микобактерий, биохимическим и клеточным исследованием ликвора, визуализирующей диагностикой (МРТ головного мозга с контрастированием).

Положительный результат ПЦР ликвора у пациента с соответствующей клинической картиной и изменениями ликвора служит основанием для немедленного начала противотуберкулёзной терапии. При туберкулёзном менингите задержка с началом лечения напрямую ассоциирована с ухудшением прогноза; эмпирическая терапия часто начинается ещё до лабораторного подтверждения при достаточно высоком клиническом подозрении, и положительный результат ПЦР подтверждает правильность выбранной тактики. Одновременно выполняется культуральное исследование для последующей верификации возбудителя и определения чувствительности к препаратам, и при доступности — молекулярные тесты на основные мутации устойчивости (к рифампицину в первую очередь) как отдельные исследования.

Отрицательный результат ПЦР ликвора не исключает туберкулёзный менингит. При сохраняющемся клиническом подозрении — особенно на фоне характерных изменений ликвора, данных МРТ и принадлежности пациента к группе высокого риска — противотуберкулёзная терапия начинается эмпирически, а диагностический поиск продолжается: рассматривается повторная люмбальная пункция с забором большего объёма ликвора, исследование биоматериалов из других потенциальных очагов (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, материал лимфоузлов), продолжается культуральное исследование. Решение об эмпирической терапии принимает лечащий врач на основании совокупности клинических и лабораторных данных.

Отдельный клинический контекст — обследование пациентов с ВИЧ-инфекцией, у которых риск развития туберкулёзного менингита существенно повышен, клиническая картина часто атипична, а прогноз хуже. Молекулярные методы в этой группе имеют особое значение, поскольку микроскопия и посев у таких пациентов нередко оказываются малоинформативными.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Главное ограничение исследования — невысокая клиническая чувствительность при туберкулёзном менингите, связанная с чрезвычайно низкой концентрацией возбудителя в ликворе; отрицательный результат не исключает заболевание и не должен использоваться как основание для исключения диагноза при сохраняющемся клиническом подозрении. Чувствительность метода существенно зависит от объёма ликвора: при объёме менее 6 мл вероятность детекции возбудителя значительно снижается. У пациентов с перенесённым туберкулёзом возможны ложноположительные результаты за счёт ДНК, сохраняющейся после завершённой терапии, — результат интерпретируется с учётом анамнеза. Качественное исследование подтверждает только наличие или отсутствие ДНК возбудителя и не определяет чувствительность к противотуберкулёзным препаратам; оценка устойчивости к рифампицину, изониазиду и препаратам второго ряда требует отдельных молекулярных исследований либо культурального исследования с определением чувствительности. Результат требует интерпретации врачом-фтизиатром совместно с неврологом и инфекционистом с учётом клинической картины, данных визуализации, биохимического и клеточного исследования ликвора, эпидемиологического анамнеза и иммунного статуса пациента.