ПЦР-диагностика микобактерий туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) в мокроте, бронхоальвеолярном лаваже

Анализ выявляет ДНК микобактерий туберкулёза (Mycobacterium tuberculosis complex) в мокроте, бронхоальвеолярной лаважной жидкости или промывных водах бронхов методом ПЦР. Результат выдаётся в формате обнаружено / не обнаружено. Исследование применяется для этиологической диагностики лёгочного туберкулёза. Респираторный материал — мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, промывные воды бронхов — относится к основным биоматериалам для прямого выявления возбудителя при подозрении на активную лёгочную инфекцию. Современные руководящие документы позиционируют молекулярное тестирование как предпочтительный первичный диагностический метод при подозрении на туберкулёз лёгких, превосходящий по чувствительности классическую микроскопию мазка на кислотоустойчивые бактерии. Посев на жидких и плотных средах сохраняет статус референсного метода: только он подтверждает жизнеспособность возбудителя и позволяет определить чувствительность к полному спектру противотуберкулёзных препаратов.

Mycobacterium tuberculosis — кислотоустойчивая палочка из семейства Mycobacteriaceae, входящая в группу Mycobacterium tuberculosis complex вместе с M. bovis, M. africanum и рядом близкородственных видов. Бактерия имеет сложную липидсодержащую клеточную стенку с миколовыми кислотами, что обеспечивает её устойчивость к фагоцитозу, высыхание и длительное сохранение в аэрозоле. Основной путь передачи — воздушно-капельный: возбудитель попадает в альвеолы с микрокаплями аэрозоля от больного активной лёгочной формой туберкулёза. Первичный аффект формируется в лёгких, откуда возбудитель через лимфатические пути достигает регионарных лимфоузлов и при ослаблении контроля со стороны клеточного иммунитета распространяется гематогенно. 
После первичного инфицирования у большинства людей развивается латентная туберкулёзная инфекция — состояние, при котором возбудитель сохраняется в гранулёмах в неактивной форме и не вызывает клинических проявлений. Реактивация происходит на фоне снижения клеточного иммунитета: при ВИЧ-инфекции, терапии ингибиторами ФНО-α и другими иммуносупрессантами, при сахарном диабете, хронических заболеваниях почек, выраженном истощении, у пожилых пациентов. 
Лёгочный туберкулёз — наиболее частая клиническая форма активного туберкулёза. Клиническая картина включает длительный кашель (более 2–3 недель), субфебрильную или фебрильную лихорадку, ночную потливость, снижение массы тела, общую слабость; при прогрессировании присоединяются кровохарканье, боли в грудной клетке, одышка. Рентгенологическая картина варьирует от инфильтративных изменений и плевральной реакции до классических полостей распада, преимущественно в верхних долях. У пациентов с ВИЧ-инфекцией на фоне выраженной иммуносупрессии клиническая и рентгенологическая картина часто атипична: кашель может быть непродуктивным, каверны отсутствуют, процесс может протекать как диссеминированная форма. 
Выбор респираторного биоматериала определяется возможностью пациента откашливать мокроту и клинической ситуацией. Самопроизвольная мокрота — первый и наиболее доступный вариант, обычно исследуются 2–3 утренние порции с интервалом между сборами. При непродуктивном кашле применяется индуцированная мокрота — получение материала после ингаляции гипертонического раствора натрия хлорида. Бронхоальвеолярный лаваж и промывные воды бронхов получают при фибробронхоскопии и применяют, когда мокроту получить не удаётся, а также при необходимости целенаправленного забора материала из очага поражения, локализованного в определённом сегменте лёгкого. У детей раннего возраста, которые не могут продуктивно откашливать мокроту, наряду с БАЛ используется желудочный аспират.

ПЦР выявляет специфические участки генома Mycobacterium tuberculosis complex — чаще всего фрагмент инсерционной последовательности IS6110, число копий которой у M. tuberculosis относительно стабильно, либо гены rpoB и hsp65 — и обладает высокой аналитической чувствительностью и специфичностью. Преимущества метода перед классической диагностикой — скорость получения результата и существенно более высокая клиническая чувствительность по сравнению с микроскопией мазка (микроскопия требует концентрации бактерий 5–10 тысяч на мл, молекулярные методы способны выявлять возбудителя при значительно более низкой нагрузке). ПЦР детектирует ДНК, а не жизнеспособные бактерии, поэтому результат отражает присутствие генетического материала в пробе, но не характеризует активность размножения возбудителя.

Клиническое значение

Исследование применяется как первичный диагностический тест при клиническом и рентгенологическом подозрении на активный лёгочный туберкулёз. Типичные показания включают длительный кашель (более 2–3 недель), субфебрильную лихорадку и потерю массы тела у взрослых, особенно при наличии эпидемиологических факторов риска или рентгенологических изменений; дифференциальную диагностику инфильтративных процессов в лёгких неясной этиологии; обследование пациентов из групп высокого риска — контактных лиц, пациентов с ВИЧ-инфекцией, реципиентов трансплантатов, пациентов на биологической иммуносупрессивной терапии. Одновременное выполнение ПЦР, микроскопии на кислотоустойчивые бактерии и посева на питательные среды составляет стандартный диагностический комплекс при подозрении на лёгочный туберкулёз.

Выбор конкретного респираторного биоматериала определяется клинической ситуацией. Мокрота остаётся основным материалом первого выбора у пациентов с продуктивным кашлем. Бронхоальвеолярный лаваж и промывные воды бронхов применяются при непродуктивном кашле и невозможности получить качественную мокроту, при подозрении на туберкулёз у пациента с рентгенологической картиной поражения определённого сегмента или доли, а также в ситуациях, когда негативные результаты исследования мокроты не снимают клинического подозрения и требуется повторная диагностика с целенаправленным забором материала. В педиатрической практике БАЛ и желудочный аспират занимают особое место из-за сложности получения мокроты у детей.

Положительный результат ПЦР у пациента с соответствующей клинической картиной служит основанием для начала противотуберкулёзной терапии и одновременно требует параллельного обследования на чувствительность возбудителя к препаратам: культуральное исследование с фенотипическим определением чувствительности и, при доступности, молекулярные тесты на основные мутации устойчивости (к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам) выполняются как отдельные исследования и в задачи данного качественного теста не входят.

Отрицательный результат ПЦР не исключает активный лёгочный туберкулёз при сохраняющемся клиническом подозрении. Чувствительность метода, будучи выше, чем у микроскопии мазка, всё же не достигает 100%, особенно при малобациллярных формах и у пациентов с ВИЧ-инфекцией. При высоком клиническом подозрении исследование повторяется на нескольких порциях мокроты, рассматривается бронхоскопия с получением БАЛ, продолжается культуральное исследование, а решение об эмпирической противотуберкулёзной терапии принимается с учётом всей совокупности клинических и лабораторных данных.

Отдельный клинический контекст — обследование пациентов с ВИЧ-инфекцией, у которых риск развития активного туберкулёза существенно повышен, а клиническая и рентгенологическая картина часто атипична. Молекулярные методы в этой группе демонстрируют более высокую диагностическую ценность по сравнению с классической микроскопией и рекомендованы как часть диагностического обследования при любом подозрении на туберкулёз.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности: положительный результат подтверждает присутствие генетического материала Mycobacterium tuberculosis в респираторном материале, но не различает активное размножение и остаточную ДНК. У пациентов с перенесённым туберкулёзом в предшествующие годы возможны ложноположительные результаты за счёт ДНК, сохраняющейся в очагах после завершённой терапии; поэтому у таких пациентов результат интерпретируется с учётом анамнеза, данных визуализации и параллельных методов, включая посев. Отрицательный результат не исключает лёгочный туберкулёз при сохраняющемся клиническом подозрении: чувствительность метода ограничена при малобациллярных формах, у пациентов с ВИЧ-инфекцией и при ранних стадиях заболевания. При высоком клиническом подозрении проводится повторное исследование на нескольких образцах, а также рассматривается бронхоскопия с получением БАЛ или промывных вод бронхов. Клиническая чувствительность зависит от качества забора материала: мокрота должна быть истинной (с нижних отделов дыхательных путей), а не слюной; недостаточный объём, ранний утренний сбор, правильное хранение и транспортировка существенно влияют на результат. Качественное исследование подтверждает только наличие или отсутствие ДНК возбудителя и не определяет чувствительность к противотуберкулёзным препаратам; при необходимости оценки устойчивости к рифампицину, изониазиду и препаратам второго ряда выполняются отдельные молекулярные исследования либо культуральное исследование с определением чувствительности, которое остаётся основным методом этиологической верификации и оценки лекарственной устойчивости. ПЦР не предназначена для контроля эффективности противотуберкулёзной терапии: остаточная ДНК может сохраняться в респираторном материале длительно после эрадикации жизнеспособных бактерий; для оценки динамики лечения применяются микроскопия мазка и посев. Результат требует интерпретации врачом-фтизиатром или профильным специалистом с учётом клинической картины, данных визуализации, эпидемиологического анамнеза, иммунного статуса и проводимой терапии.