ПЦР-диагностика грибов рода кандида (C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis), из различных локализаций

Анализ выявляет ДНК пяти клинически значимых видов рода Candida — Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis — методом ПЦР с количественной оценкой содержания возбудителя в пробе. Биоматериал выбирается лечащим врачом в зависимости от задачи обследования: соскоб из уретры, влагалища или цервикального канала; мазок из ротоглотки; мокрота; бронхоальвеолярный лаваж. Результат выдаётся раздельно по каждому из пяти видов с указанием количества копий ДНК в пробе.

Род Candida объединяет дрожжеподобные грибы, входящие в состав нормальной микрофлоры человека и при определённых условиях вызывающие заболевания различной тяжести, от поверхностных кандидозов слизистых до инвазивных форм с высокой летальностью. Видовая идентификация Candida имеет практическое значение из-за существенных различий в чувствительности к противогрибковым препаратам и в клинических нишах, типичных для разных видов.

Candida albicans — основной и наиболее распространённый возбудитель кандидозов у человека, на его долю приходится большинство случаев в большинстве клинических локализаций. Биологическая особенность вида — способность к морфологическому переходу между дрожжевой формой и формой гиф (псевдомицелия и истинного мицелия) в зависимости от условий: дрожжевая форма характерна для комменсального существования на слизистых, гифальная — для инвазии в эпителий и развития инфекции. Этот переход — один из ключевых механизмов вирулентности возбудителя. C. albicans вызывает большинство случаев вульвовагинального кандидоза, орофарингеального кандидоза, кожного кандидоза, кандидозного эзофагита у иммунокомпрометированных, а также значительную часть инвазивных форм, в том числе кандидемии. Вид сохраняет чувствительность к стандартным противогрибковым препаратам — флуконазолу, эхинокандинам, амфотерицину B, — и при инфекциях, вызванных C. albicans, эмпирическая терапия флуконазолом обычно эффективна.

Candida glabrata — второй по частоте возбудитель кандидозов в большинстве регионов, и его доля в инвазивных формах в последние десятилетия растёт. Биологически вид отличается от C. albicans отсутствием гифообразования: C. glabrata существует только в дрожжевой форме, что не уменьшает её патогенного потенциала, но определяет некоторые особенности клинической картины и патогенеза. Вид чаще обнаруживается у пожилых пациентов, у пациентов с сахарным диабетом, в реанимационных и онкологических отделениях, при рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. Клинически наиболее значимая особенность C. glabrata — природно сниженная чувствительность к флуконазолу с тенденцией к развитию приобретённой устойчивости при длительной терапии азолами. У этого вида также описана растущая устойчивость к эхинокандинам, что делает его одним из проблемных возбудителей в современной терапии инвазивного кандидоза. Эмпирическое назначение флуконазола при инфекциях, вызванных C. glabrata, может оказаться недостаточно эффективным, и видовая идентификация позволяет лечащему врачу скорректировать выбор препарата на ранней стадии.

Candida krusei (по современной таксономии Pichia kudriavzevii) — менее распространённый, но клинически значимый вид, чьё главное отличие от других видов рода — природная устойчивость к флуконазолу. Эта устойчивость делает обнаружение C. krusei принципиально важной находкой: эмпирическая флуконазольная терапия в этом случае не работает, и для лечения требуется выбор препарата другой группы (эхинокандины, амфотерицин B). Типичная клиническая ниша вида — пациенты с гематологическими злокачественными новообразованиями, реципиенты трансплантата костного мозга, пациенты после длительной флуконазольной профилактики, на фоне которой возбудитель становится преимущественной грибковой флорой. У онкогематологических пациентов C. krusei — один из значимых возбудителей кандидемии и инвазивного кандидоза, и его раннее выявление имеет прямое практическое значение для тактики ведения.

Candida parapsilosis — вид с особым клиническим профилем, связанным с его выраженной способностью к биоплёнкообразованию на поверхностях медицинских изделий и катетеров. Это определяет типичные клинические ниши вида: катетер-ассоциированные инфекции кровотока, инфекции у пациентов на длительном парентеральном питании, у пациентов с протезированными клапанами сердца, в отделениях интенсивной терапии. Особое место C. parapsilosis занимает в неонатологии: у новорождённых с очень низкой массой тела этот вид — один из ведущих возбудителей неонатального кандидоза. Биологически C. parapsilosis обычно сохраняет чувствительность к флуконазолу, но имеет сниженную чувствительность к эхинокандинам, что меняет логику выбора эмпирической терапии при подтверждённой инфекции этим видом.

Candida tropicalis — вид с агрессивным клиническим поведением и тенденцией к диссеминации при инвазивных формах. Типичная клиническая ниша — онкогематологические пациенты, особенно с нейтропенией на фоне химиотерапии, у которых вид часто становится причиной кандидемии и диссеминированного кандидоза с высокой летальностью. C. tropicalis распространён шире в тропических и субтропических регионах. Чувствительность вида к стандартным противогрибковым препаратам сохраняется в большинстве случаев, но скорость прогрессирования инфекции и склонность к диссеминации делают раннее выявление возбудителя важным условием своевременной терапии. Обнаружение C. tropicalis в нестерильных локусах у онкогематологического пациента — значимая находка, заслуживающая внимания.

Количественный формат теста — основное преимущество по сравнению с качественным определением. На нестерильных биоматериалах количественная оценка содержания возбудителя помогает в сочетании с картиной заболевания поддержать или ослабить версию активной инфекции: значительное количество ДНК у пациента с симптомами поддерживает кандидозную этиологию, небольшие количества у бессимптомного человека чаще отражают носительство. Универсальные количественные пороги, по которым можно надёжно разграничить колонизацию и инфекцию, разработаны не для всех биоматериалов, и интерпретация результата строится с учётом ситуации, типа биоматериала, состояния пациента.

Метод ПЦР выявляет видоспецифические участки генома каждого из пяти включённых видов. Метод не зависит от жизнеспособности возбудителя, сохраняет чувствительность при низком его содержании, обеспечивает быстрый ответ по сравнению с культуральным исследованием.

Клиническое значение

Главная задача теста — этиологическая идентификация Candida с разграничением между основным видом C. albicans и четырьмя non-albicans видами, имеющими важные различия в чувствительности к противогрибковым препаратам. Стандартная эмпирическая терапия кандидоза у иммунокомпетентного пациента обычно строится на флуконазоле, активном в отношении C. albicans. Если возбудителем оказывается C. krusei с природной устойчивостью или C. glabrata со сниженной чувствительностью к флуконазолу, эмпирическая схема может быть недостаточно эффективной, и видовая идентификация позволяет лечащему врачу скорректировать выбор препарата. Эта роль теста особенно важна при рецидивирующих и упорных формах кандидоза, при неэффективности первичной терапии, у иммунокомпрометированных пациентов, в реанимационных ситуациях.

Вторая задача — количественная оценка содержания возбудителя в нестерильных локализациях. Candida может присутствовать в составе нормальной микрофлоры без участия в развитии заболевания, и количественная оценка в сочетании с картиной заболевания помогает оценить выраженность присутствия возбудителя.

Третья задача — общая характеристика грибковой флоры в обследуемой локализации в комплексной оценке пациента. Это практически значимо у иммунокомпрометированных пациентов и в реанимационных ситуациях, где обнаружение non-albicans видов с особенностями устойчивости влияет на эмпирическую тактику.

Положительный результат подтверждает присутствие ДНК соответствующего вида Candida в пробе. Значимость находки определяется в совокупности тремя параметрами: видовой принадлежностью, количественной выраженностью, типом биоматериала и состоянием пациента. У пациента с типичной картиной кандидоза находка значительного количества возбудителя поддерживает диагноз. На респираторном биоматериале интерпретация требует особой осторожности: даже значительное количество Candida в мокроте или бронхоальвеолярном лаваже чаще отражает колонизацию дыхательных путей, чем истинный кандидозный пневмонит, диагноз которого требует морфологического подтверждения с выявлением инвазии возбудителя в ткань лёгкого. Тактика определяется лечащим врачом.

Отрицательный результат по всем пяти видам снижает вероятность участия Candida в развитии симптомов или процесса в исследованной локализации. Отрицательный результат не исключает других, не входящих в тест видов рода Candida, и других грибковых возбудителей.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Тест охватывает пять видов рода Candida; другие виды (C. dubliniensis, C. lusitaniae, C. guilliermondii и более редкие) данным исследованием не выявляются. Биоматериалы из нестерильных локализаций естественно содержат микрофлору, в составе которой может присутствовать Candida как часть колонизации без участия в развитии заболевания. Из-за этого молекулярное обнаружение Candida не разграничивает колонизацию и активную инфекцию автоматически; интерпретация требует учёта картины заболевания и состояния пациента. Количественная оценка содержания возбудителя помогает в этой интерпретации, но универсальные количественные пороги для разграничения колонизации и инфекции разработаны не для всех биоматериалов. На результат влияет предшествующая противогрибковая терапия, снижающая количество возбудителя в пробе. Качество забора материала имеет значение для результата. Результат исследования требует интерпретации врачом — гинекологом, урологом, оториноларингологом, инфекционистом, пульмонологом, реаниматологом — с учётом локализации забора материала, картины заболевания, факторов риска кандидозной инфекции, состояния пациента и общей ситуации.