ПЦР-диагностика и типирование диарогенных эшерихий (E. coli) в кале

Анализ выявляет ДНК диареегенных E. coli (DEC) пяти патогенетических типов в образце кала методом ПЦР: энтеропатогенных (EPEC), энтеротоксигенных (ETEC), энтероинвазивных (EIEC), энтерогеморрагических (EHEC), энтероаггрегативных (EAgEC). Биоматериал — кал, собираемый в стерильную одноразовую ёмкость с ложечкой. Результат выдаётся раздельно по каждому типу в формате обнаружено / не обнаружено. 
E. coli — представитель нормальной микрофлоры кишечника человека: большинство штаммов безвредны и составляют часть кишечного микробиоценоза. Однако небольшая часть E. coli приобрела факторы вирулентности, превратившие их в самостоятельных возбудителей острых кишечных инфекций. Эти патогенные варианты объединяются под названием «диареегенные E. coli» и разделяются на патогенетические типы по механизму поражения кишечника, клинической картине и эпидемиологии. Каждый тип имеет собственные особенности, и идентификация патогенетического типа даёт лечащему врачу понимание этиологии заболевания и обоснование тактики ведения.

EPEC , энтеропатогенные E. coli — один из значимых возбудителей детских кишечных инфекций, особенно у детей первого года жизни. Возбудитель прикрепляется к энтероцитам тонкой кишки и вызывает характерное поражение микроворсинок (так называемое «attaching and effacing» поражение), нарушающее всасывание. Клинически это проявляется водянистой диареей, рвотой, лихорадкой; у детей раннего возраста инфекция может приводить к выраженному обезвоживанию и требовать госпитализации. У взрослых EPEC встречается реже и обычно протекает легче.

ETEC , энтеротоксигенные E. coli — главный возбудитель «диареи путешественников» и одна из ведущих причин детской диареи в развивающихся странах. Возбудитель колонизирует тонкую кишку и вырабатывает энтеротоксины (термолабильный LT, термостабильный ST), которые нарушают регуляцию секреции жидкости и электролитов в просвет кишечника. Клинически ETEC-инфекция проявляется обильной водянистой диареей без крови и слизи, часто без лихорадки или с невысокой температурой, с быстрым риском обезвоживания. Заражение происходит через загрязнённую воду и пищу, что и определяет классическую эпидемиологию у путешественников в эндемичные регионы.

EIEC , энтероинвазивные E. coli — патогенетический тип, близкий по механизму действия к шигеллам. Возбудитель внедряется в эпителиальные клетки толстой кишки, размножается внутри них и вызывает их разрушение. Клинически это проявляется дизентериеподобным синдромом: лихорадка, схваткообразные боли в животе, кровянистая или слизистая диарея, тенезмы. Заболевание клинически и патогенетически близко к шигеллёзу, и без лабораторной идентификации возбудителя их разграничение затруднительно.

EHEC , энтерогеморрагические E. coli — клинически наиболее опасная группа диареегенных эшерихий. Главный представитель — E. coli серотипа O157:H7, хотя в эту группу входят и другие серотипы. Возбудитель вырабатывает шига-токсины (Stx1 и Stx2), которые повреждают эндотелий мелких сосудов и вызывают кровоизлияния в стенке кишечника, а при системном действии — гемолитико-уремический синдром (ГУС). Клиническая картина включает водянистую диарею в начале заболевания, переходящую в кровянистую с выраженными болями в животе, обычно без выраженной лихорадки. У части пациентов, особенно у детей и пожилых, через несколько дней развивается ГУС с гемолитической анемией, тромбоцитопенией и острой почечной недостаточностью — состоянием, требующим интенсивного лечения и потенциально жизнеугрожающим. Особенность EHEC-инфекции — нежелательность антибактериальной терапии в большинстве случаев: она может усиливать выброс шига-токсинов и повышать риск ГУС. Заражение происходит чаще через недостаточно обработанное мясо, непастеризованное молоко, заражённые овощи и воду.

EAgEC , энтероаггрегативные E. coli — патогенетический тип с характерным агрегативным типом прикрепления к эпителию кишечника, образующим характерные «кирпичные» скопления возбудителя на поверхности слизистой. Клинически EAgEC ассоциированы с острой и хронической диареей, особенно у детей в развивающихся странах и у иммунокомпрометированных пациентов; могут вызывать диарею путешественников. Хроническая EAgEC-инфекция у детей способствует нарушениям питания и задержке развития. Клиническая картина у взрослых обычно умеренная: водянистая диарея, иногда с примесью слизи, без выраженной лихорадки.

Стандартная диагностика острых кишечных инфекций строится на сочетании клинической картины, эпидемиологического анамнеза и лабораторных методов. Культуральное исследование кала — традиционный метод, но в отношении диареегенных E. coli оно имеет существенные ограничения: рутинные питательные среды не отличают патогенные штаммы от нормальной кишечной флоры, а специализированные исследования (например, выявление E. coli O157:H7 на сорбитолсодержащих средах) выполняются не во всех лабораториях. Молекулярная диагностика — ПЦР с раздельным выявлением патогенетических типов — обеспечивает быструю и специфичную этиологическую идентификацию, недостижимую культуральными методами для большинства типов DEC.

Метод ПЦР выявляет специфические для каждого патогенетического типа участки генома, ассоциированные с факторами вирулентности. Метод не зависит от жизнеспособности возбудителя, сохраняет чувствительность при низком содержании ДНК в пробе и обеспечивает быстрый результат, что важно для своевременной тактики при острых кишечных инфекциях.

Клиническое значение

Тест применяется при острой диарее у детей и взрослых, когда требуется этиологическая идентификация возбудителя. Особенно полезен в ситуациях, где быстрый этиологический ответ напрямую влияет на тактику ведения и эпидемиологические меры: при групповых случаях диареи и пищевых вспышках, при кровянистой диарее, при тяжёлом обезвоживании у детей раннего возраста, при диарее путешественников после поездок в эндемичные регионы, у иммунокомпрометированных пациентов с тяжёлым или затяжным течением кишечной инфекции.

Особую роль тест играет при подозрении на инфекцию EHEC. У пациентов с кровянистой диареей, при подозрении на гемолитико-уремический синдром, при признаках поражения почек на фоне предшествующей кишечной инфекции раннее выявление EHEC помогает лечащему врачу вовремя оценить риск развития ГУС и принять решения о наблюдении и о применимости антибактериальной терапии (которая в этих случаях обычно нежелательна).

Тест применяется в дифференциальной диагностике острых кишечных инфекций, когда клиническая картина (дизентериеподобный синдром, кровянистая диарея, водянистая диарея с обезвоживанием) допускает несколько возможных этиологий и требуется лабораторное уточнение возбудителя.

Положительный результат на любой из пяти типов подтверждает присутствие соответствующего патогенетического типа диареегенных E. coli в исследованной пробе. У пациента с клинической картиной острой кишечной инфекции это служит этиологическим подтверждением заболевания. Тактика определяется лечащим врачом — инфекционистом, педиатром, терапевтом — с учётом клинической картины, тяжести состояния и особенностей выявленного типа возбудителя.

Отрицательный результат по всем пяти типам снижает вероятность участия диареегенных E. coli в развитии острой кишечной инфекции. При сохраняющейся клинической картине диагностический поиск продолжается с учётом других возможных возбудителей: бактериальных (Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia, Clostridium difficile), вирусных (ротавирусы, норовирусы, аденовирусы), паразитарных, не входящих в охват данного теста.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Тест охватывает пять патогенетических типов диареегенных E. coli; шестой описанный тип — диффузно-адгерентные E. coli (DAEC) — данным исследованием не выявляется. Тест не выявляет других возбудителей острых кишечных инфекций — сальмонелл, шигелл, Campylobacter, Yersinia, C. difficile, ротавирусов, норовирусов, паразитарных возбудителей, для диагностики которых выполняются отдельные исследования. Качественный формат теста не даёт количественной оценки содержания возбудителя в пробе. На чувствительность метода влияет предшествующая антибактериальная терапия. Качество биоматериала имеет значение для результата: образец кала должен быть собран в стерильную ёмкость и доставлен в лабораторию в установленные сроки. Результат исследования требует интерпретации врачом — инфекционистом, педиатром, терапевтом — с учётом клинической картины, эпидемиологического анамнеза, результатов сопутствующих исследований и общей ситуации.