Оценка способности нейтрофилов к окислительному взрыву - дигидрородаминовый тест, проточная цитометрия, Burst-тест

Краткое описание нейтрофилов

Нейтрофилы — это тип белых кровяных клеток (лейкоцитов), относящихся к гранулоцитам. Они составляют основную часть лейкоцитов в крови человека (50–70% от общего числа лейкоцитов) и являются ключевыми компонентами иммунной системы. Нейтрофилы образуются в костном мозге и циркулируют в крови, быстро реагируя на инфекции или воспаление. Функция нейтрофилов заключается в поглощении микробов, а окислительный взрыв или кислород зависимый киллинг является одним из ключевых механизмов их антимикробной активности, позволяя эффективно уничтожать патогены. При окислительном(респираторном) взрыве нейтрофилы (а также другие фагоциты, такие как макрофаги) продуцируют активные формы кислорода (АФК), такие как супероксидный анион (O₂⁻), перекись водорода (H₂O₂) и гипохлорит (HOCl). Этот процесс происходит в ответ на стимуляцию патогенами или химическими агентами и является ключевым механизмом уничтожения микроорганизмов. Нарушения данного механизма лежат в основе целого ряда заболеваний, наиболее тяжелым из которых является хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) — первичный иммунодефицит, характеризующийся рецидивирующими бактериальными и грибковыми инфекциями. В связи с этим, оценка способности нейтрофилов к окислительному взрыву является ключевой диагностической процедурой в клинической иммунологии. Исторически для этого использовался нитросиний тетразолиевый тест (НСТ-тест), однако в настоящее время «золотым стандартом» является дигидрородаминовый тест с проточной цитометрией.

Принцип метода дигидрородаминового теста

Дигидрородаминовый тест (DHR 123 test) — это высокочувствительный цитометрический метод, позволяющий количественно оценить генерацию активных форм кислорода (АФК) в нейтрофилах. Метод основан на уникальных свойствах красителя дигидрородамина 123 (DHR). DHR представляет собой нетоксичное, незаряженное соединение, легко проникающее через клеточные мембраны путем пассивной диффузии. Внутри клетки эстеразы отщепляют его ацетатные группы, превращая в родамин 123, который накапливается в митохондриях. Ни DHR, ни исходный родамин 123 не являются флуоресцентными. При активации NADPH-оксидазы и генерации АФК (в первую очередь, перекиси водорода – H₂O₂) родамин 123 окисляется. Продукт окисления — флуоресцентный родамин 123 — обладает яркой зеленой флуоресценцией при возбуждении аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Интенсивность флуоресценции, регистрируемая детектором проточного цитометра, прямо пропорциональна количеству произведенных АФК. Для оценки максимального функционального потенциала нейтрофилов проводится стимуляция бактериями E. coli или мощным специфическим агентом — форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА), который напрямую активирует протеинкиназу C и, следовательно, NADPH-оксидазный комплекс, продуцируя активные формы кислорода.

Преимуществами DHR-теста являются высокая чувствительность и специфичность( позволяет оценить количество нейтрофилов, способных к окислительному взрыву и измерить интенсивность ответа каждой клетки), быстрый результат (в течение рабочего дня), возможность количественной оценки, подходит для скрининга, диагностики, мониторинга, применим в детской практике и при трансплантационном наблюдении.

Любые дефекты механизме образования АФК приводят к снижению бактерицидной активности, развитию рецидивирующих инфекций и гранулёматозного воспаления. Наиболее часто встречаются :

Хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ, CGD)

Возникает в результате мутации в генах, кодирующих компоненты ферментного комплекса NADPH-оксидазы (фагоцитная оксидаза). Этот комплекс в норме активируется при фагоцитозе и переносит электроны на молекулярный кислород, образуя супероксид-анион (O₂⁻) — первичную АФК, которая служит предшественником для других бактерицидных соединений (H₂O₂, гипохлорита). Если комплекс NADPH-оксидазы не собирается или не функционирует, "окислительный взрыв" не происходит. Для заблевания характерны тяжелые, рецидивирующие инфекции, вызываемые каталаз-положительными микроорганизмами (например, S. aureus, Burkholderia cepacia, Serratia marcescens, Aspergillus spp., Nocardia). Проявляется образованием гранулем (воспалительных узелков) в различных органах (коже, легких, ЖКТ, печени) как следствие хронического воспаления и неспособности очистить инфекцию. Наиболее частые локализации инфекций - легкие (пневмонии), кожа (абсцессы, целлюлит), лимфоузлы, печень и селезенка (абсцессы).
Тип наследования ~70% случаев — X-сцепленное (мутация в гене CYBB, кодирующем gp91phox); ~30% — аутосомно-рецессивное (мутации в генах CYBA (p22phox), NCF1 (p47phox), NCF2 (p67phox), NCF4 (p40phox)).

Дефицит миелопероксидазы (МПО)

Дефект заключается в отсутствии или дефиците фермента миелопероксидазы в азурофильных гранулах нейтрофилов. Миелопероксидаза использует перекись водорода (H₂O₂) для производства гипохлорита (HOCl⁻ — активный компонент "бытового" отбеливателя), который является самым мощным бактерицидным агентом нейтрофила. При этом дефиците первичный "взрыв" (генерация супероксида и H₂O₂) сохранен, но финальный, самый эффективный этап киллинга нарушен. В отличие от ХГБ, протекает значительно легче и часто бессимптомно. Это связано с тем, что другие механизмы киллинга (независимые от МПО) компенсируют дефект. Наиболее уязвимы пациенты с сопутствующим сахарным диабетом, у которых на фоне дефицита МПО могут развиваться рецидивирующие кандидозные инфекции (например, кандидоз кожи и слизистых).
Тип наследования: Аутосомно-рецессивный.

Дефицит глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G6PD)

Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) — это наследственное заболевание, связанное с нарушением функции фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, который играет ключевую роль в пентозофосфатном пути обмена веществ. Этот фермент необходим для выработки NADPH, который поддерживает антиоксидантную защиту клеток (особенно эритроцитов) и участвует в продукции активных форм кислорода (АФК) в нейтрофилах. Дефицит G6PD чаще всего проявляется гемолитической анемией, но также может влиять на функцию фагоцитов, включая окислительный взрыв. Наиболее распространен в регионах с высокой заболеваемостью малярией (Африка, Средиземноморье, Ближний Восток, Юго-Восточная Азия), так как дефицит G6PD может обеспечивать частичную защиту от малярии.  При недостаточной активности G6PD уровень NADPH падает. Это приводит к истощению запасов восстановленного глутатиона (GSH), в результате у эритроцитов нарушается защита от окислительного взрыва. Воздействие провоцирующих факторов повреждают их мембраны и гемоглобин, что может приводить к гемолитическим кризам. В обычных условиях (без воздействия триггеров) болезнь может не проявляться. Тяжелые формы (<1% от нормы)  могут клинически напоминать ХГБ с тяжелыми рецидивирующими инфекциями.
Тип наследования: X-сцепленный.