Окислительный взрыв нейтрофилов, дигидрородаминовый тест (DHR), Burst-тест

Нейтрофилы - это тип белых кровяных клеток (лейкоцитов), относящихся к гранулоцитам. Они составляют основную часть лейкоцитов в крови человека (50–70% от общего числа лейкоцитов) и являются ключевыми компонентами иммунной системы. Нейтрофилы образуются в костном мозге и циркулируют в крови, быстро реагируя на инфекции или воспаление. Функция нейтрофилов заключается в поглощении микробов, а окислительный взрыв или кислородзависимый киллинг является одним из ключевых механизмов их антимикробной активности, позволяя эффективно уничтожать патогены. При окислительном, или респираторном, взрыве NADPH-оксидазный комплекс нейтрофилов образует супероксид-анион, из которого далее формируются перекись водорода и другие реактивные формы кислорода. В нейтрофилах миелопероксидаза использует перекись водорода и хлорид-ионы для образования хлорноватистой кислоты — HOCl, обладающей выраженной микробицидной активностью. Другие фагоциты, включая макрофаги, также способны активировать NADPH-оксидазный комплекс, однако состав и количество образующихся окислителей различаются. Этот процесс происходит в ответ на стимуляцию патогенами или химическими агентами и является ключевым механизмом уничтожения микроорганизмов. Нарушения данного механизма лежат в основе целого ряда заболеваний, наиболее тяжелым из которых является хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) - первичный иммунодефицит, характеризующийся рецидивирующими бактериальными и грибковыми инфекциями. В связи с этим оценка способности нейтрофилов к окислительному взрыву является ключевой диагностической процедурой в клинической иммунологии. Исторически для этого использовался нитросиний тетразолиевый тест (НСТ-тест), однако в настоящее время «золотым стандартом» является дигидрородаминовый тест с проточной цитометрией.

Принцип метода дигидрородаминового теста

Дигидрородаминовый тест (DHR 123 test) — высокочувствительный цитометрический метод, позволяющий количественно оценить окислительный ответ нейтрофилов после лабораторной стимуляции. Метод основан на уникальных свойствах красителя дигидрородамина 123 (DHR). DHR 123 представляет собой восстановленный, практически нефлуоресцентный краситель, способный проникать внутрь клеток. После стимуляции нейтрофилов активируется NADPH-оксидазный комплекс, который переносит электроны с NADPH на молекулярный кислород с образованием супероксид-аниона. В результате последующих реакций, включая дисмутацию супероксида, образуются перекись водорода и другие реактивные формы кислорода. При участии внутриклеточных пероксидаз, прежде всего миелопероксидазы, дигидрородамин 123 окисляется до флуоресцентного родамина 123. Образовавшийся родамин 123 накапливается в клетке и испускает зелёную флуоресценцию при возбуждении лазером с длиной волны 488 нм. Увеличение флуоресценции стимулированных нейтрофилов регистрируют методом проточной цитометрии. Для оценки разных этапов функционального ответа нейтрофилы стимулируют бактериями E. coli и форбол-12-миристат-13-ацетатом — ФМА, или PMA. Ответ на E. coli зависит от распознавания и поглощения бактерий и отражает фагоцитоз-зависимую активацию окислительного взрыва. ФМА является мощным нефизиологическим фармакологическим стимулятором протеинкиназы C: он обходит рецепторные и фагоцитарные этапы активации и вызывает выраженную активацию NADPH-оксидазного комплекса. Сопоставление ответов на E. coli и ФМА помогает различать дефект окислительного метаболизма и нарушения более ранних этапов взаимодействия нейтрофила с микроорганизмом.
К преимуществам DHR-теста относятся высокая чувствительность, количественная оценка доли нейтрофилов, ответивших на стимуляцию, и интенсивности флуоресцентного ответа каждой клетки. Проточная цитометрия позволяет выявлять полное отсутствие окислительного взрыва, частично сохранённую активность при гипоморфных вариантах и две отдельные популяции нейтрофилов у женщин — носительниц Х-сцепленной формы ХГБ. Метод применяется для диагностики дефектов NADPH-оксидазного комплекса, выявления носительства Х-сцепленной ХГБ и оценки восстановления функции нейтрофилов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Результат не является абсолютно специфичным для ХГБ и требует сопоставления с клиническими и дополнительными лабораторными данными.

Дефекты в механизме образования АФК приводят к снижению бактерицидной активности, развитию рецидивирующих инфекций и гранулёматозного воспаления. Наиболее часто встречаются:

Хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ, CGD)

Хроническая гранулематозная болезнь возникает вследствие патогенных вариантов генов, кодирующих субъединицы фагоцитарного NADPH-оксидазного комплекса или белки, необходимые для его сборки и стабильности. Нарушение работы комплекса приводит к отсутствию или значительному снижению образования супероксид-аниона и последующих реактивных форм кислорода в активированных фагоцитах. Этот комплекс в норме активируется при фагоцитозе и переносит электроны на молекулярный кислород, образуя супероксид-анион (O₂⁻) - первичную реактивную форму кислорода, из которой далее образуется перекись водорода, а при участии миелопероксидазы и хлорид-ионов — хлорноватистая кислота HOCl. При полном дефекте NADPH-оксидазного комплекса окислительный взрыв отсутствует или резко снижен. При гипоморфных вариантах сохраняется остаточная активность комплекса, поэтому DHR-тест выявляет частичный флуоресцентный ответ, выраженность которого зависит от конкретного молекулярного дефекта. Для заболевания характерны тяжелые, рецидивирующие инфекции, вызываемые каталазоположительными микроорганизмами (например, S. aureus, Burkholderia cepacia, Serratia marcescens, Aspergillus spp., Nocardia). Проявляется образованием гранулем (воспалительных узелков) в различных органах (коже, легких, ЖКТ, печени) как следствие хронического воспаления и неспособности очистить инфекцию. Наиболее частые локализации инфекций - легкие (пневмонии), кожа (абсцессы, целлюлит), лимфоузлы, печень и селезенка (абсцессы).
Около двух третей случаев ХГБ связано с Х-сцепленными патогенными вариантами гена CYBB, кодирующего gp91phox. Аутосомно-рецессивные формы обусловлены биаллельными патогенными вариантами генов CYBA, кодирующего p22phox, CYBC1, кодирующего белок EROS, NCF1, кодирующего p47phox, NCF2, кодирующего p67phox, или NCF4, кодирующего p40phox.

Дефицит миелопероксидазы (МПО)

Дефект заключается в отсутствии или дефиците фермента миелопероксидазы в азурофильных гранулах нейтрофилов. Миелопероксидаза использует перекись водорода и хлорид-ионы для образования хлорноватистой кислоты — HOCl. В водной среде HOCl находится в кислотно-основном равновесии с гипохлорит-ионом OCl⁻. Эти соединения относятся к важным микробицидным окислителям, образующимся в фагосоме активированного нейтрофила. В отличие от ХГБ, протекает значительно легче и часто бессимптомно. Это связано с тем, что другие механизмы киллинга (независимые от МПО) компенсируют дефект. Наиболее уязвимы пациенты с сопутствующим сахарным диабетом, у которых на фоне дефицита МПО могут развиваться рецидивирующие кандидозные инфекции (например, кандидоз кожи и слизистых).
Тип наследования: Аутосомно-рецессивный.

Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD)

Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) - это наследственное заболевание, связанное с нарушением функции фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, который играет ключевую роль в пентозофосфатном пути обмена веществ. Этот фермент необходим для выработки NADPH, который поддерживает антиоксидантную защиту клеток (особенно эритроцитов) и участвует в продукции активных форм кислорода (АФК) в нейтрофилах. Дефицит G6PD чаще всего проявляется гемолитической анемией, но также может влиять на функцию фагоцитов, включая окислительный взрыв. Наиболее распространен в регионах с высокой заболеваемостью малярией (Африка, Средиземноморье, Ближний Восток, Юго-Восточная Азия), так как дефицит G6PD может обеспечивать частичную защиту от малярии. При снижении активности G6PD уменьшается образование NADPH, необходимого для поддержания восстановленного глутатиона. В эритроцитах это ослабляет защиту от окислительного стресса: воздействие лекарственных препаратов, инфекций, некоторых пищевых продуктов и других провоцирующих факторов может повреждать мембрану и гемоглобин и вызывать гемолиз. Большинство распространённых вариантов G6PD-дефицита не сопровождается выраженным нарушением функции фагоцитов. Однако редкие тяжёлые формы с крайне низкой остаточной активностью фермента могут снижать образование NADPH в нейтрофилах, нарушать респираторный взрыв, давать патологический DHR-ответ и клинически напоминать хроническую гранулематозную болезнь.
Тип наследования: X-сцепленный.

Что влияет на результат

На результат DHR-теста могут влиять лекарственные препараты, в частности парацетамол, способный временно снижать окислительный ответ нейтрофилов. Сниженный или атипичный DHR-сигнал возможен при полном дефиците миелопероксидазы и редких тяжёлых формах дефицита G6PD, что учитывают при дифференциальной диагностике с хронической гранулематозной болезнью. Выраженность ответа зависит от остаточной активности NADPH-оксидазного комплекса; при некоторых вариантах заболевания, включая NCF4-ассоциированные формы, результат может быть нормальным или пограничным. Интерпретацию проводят с учётом клинической картины, лекарственного анамнеза и результатов дополнительных исследований.