Мутационный статус генов вариабельной области тяжёлой цепи иммуноглобулина (IGHV), ПЦР и секвенирование

Исследование определяет мутационный статус клонального перестроенного гена IGHV по степени его сходства с соответствующей герминальной последовательностью. Гены IGHV кодируют V-сегмент вариабельной области тяжёлой цепи иммуноглобулина, которая входит в состав антигенсвязывающей части В-клеточного рецептора. Во время созревания В-лимфоцитов происходит перестройка генов IGHV, IGHD и IGHJ с образованием индивидуальной последовательности рецептора. После антигенной стимуляции в вариабельных областях иммуноглобулинов возникают соматические гипермутации, а последующий отбор В-клеток закрепляет варианты рецепторов с изменёнными свойствами связывания антигена. При хроническом лимфоцитарном лейкозе (ХЛЛ) опухолевые В-лимфоциты происходят из одного клеточного клона и сохраняют характерную для него IGHV-IGHD-IGHJ-перестройку. Степень соматической гипермутации IGHV отражает иммуногенетические свойства этого клона и остаётся стабильной в течение заболевания. Мутированный и немутированный варианты IGHV различаются по особенностям В-клеточного рецептора, активности связанных с ним сигнальных путей и характеру течения ХЛЛ, поэтому мутационный статус входит в число основных молекулярных прогностических характеристик заболевания. 
При анализе последовательность клональной IGHV-IGHD-IGHJ-перестройки сопоставляют с наиболее близким герминальным IGHV-геном и рассчитывают процент идентичности. 

Клиническое значение

Определение мутационного статуса IGHV используется для прогностической стратификации хронического лимфоцитарного лейкоза . Мутированный и немутированный варианты ХЛЛ различаются по биологическим свойствам опухолевого клона и среднему темпу развития заболевания. При мутированном IGHV чаще наблюдается более медленное прогрессирование и более продолжительный период от установления диагноза до появления показаний к терапии. Немутированный статус ассоциирован с более активным течением ХЛЛ, более коротким временем до первой терапии и повышенной вероятностью прогрессирования. Эти различия сохраняют клиническую информативность уже на этапе первичной характеристики заболевания, в том числе у пациентов, которым после установления диагноза лечение пока не требуется. Клиническое течение ХЛЛ значительно варьирует. У части пациентов заболевание годами сохраняется стабильным, тогда как у других постепенно увеличивается опухолевая масса, нарастает лимфоцитоз, увеличиваются лимфатические узлы и селезёнка, развиваются цитопении и другие признаки активности процесса. Мутационный статус IGHV помогает оценить вероятность более раннего прогрессирования и используется в прогностических системах ХЛЛ. Он входит в международный прогностический индекс CLL-IPI наряду со статусом TP53, концентрацией β2-микроглобулина, клинической стадией и возрастом пациента. IGHV также включён в модели, оценивающие вероятность и сроки начала первой терапии у пациентов, находящихся под наблюдением. 
Мутационный статус IGHV учитывают и при выборе лечебной стратегии . Наиболее выраженная зависимость результатов лечения от IGHV была показана для химиоиммунотерапии: немутированный вариант ассоциировался с менее продолжительным контролем заболевания, тогда как у части пациентов с мутированным IGHV достигались длительные ремиссии. Современная терапия ХЛЛ преимущественно основана на таргетных препаратах, воздействующих на ключевые механизмы выживания опухолевых В-клеток, включая сигнальный путь В-клеточного рецептора и белок BCL2. При таких схемах влияние IGHV на продолжительность ответа отличается от наблюдавшегося при традиционной химиоиммунотерапии, однако показатель продолжает характеризовать биологический риск заболевания. Перед началом лечения его интерпретируют вместе со статусом TP53, делецией 17p и другими молекулярными и цитогенетическими характеристиками опухолевого клона. 
Мутационный статус IGHV обычно не меняется по мере течения ХЛЛ . Соматическая гипермутация формируется до клинического проявления заболевания и отражает иммуногенетическую историю В-клетки, из которой возник опухолевый клон. Поэтому принадлежность ХЛЛ к мутированному или немутированному варианту сохраняется при прогрессировании и после проведённой терапии, а исследование обычно выполняют однократно. Для изменений TP53 и делеции 17p действует другой принцип: в процессе клональной эволюции и под селективным воздействием терапии могут появляться или увеличиваться субклоны с новыми генетическими нарушениями, поэтому эти показатели повторно оценивают перед последующими линиями лечения. 
Результаты с 97,00–97,99% идентичности герминальному IGHV формально относятся к мутированному варианту, однако располагаются непосредственно у принятой классификационной границы. Эта группа неоднородна по иммуногенетическим характеристикам и клиническому течению. На прогноз могут влиять конкретная IGHV-IGHD-IGHJ-перестройка и принадлежность опухолевого клона к определённым стереотипным подгруппам В-клеточного рецептора. Поэтому при значениях, близких к 98%, для оценки результата учитывают точный процент идентичности и характеристики выявленной перестройки.

Мутационный статус IGHV дополняет молекулярную и цитогенетическую характеристику ХЛЛ . Его сопоставление со статусом TP53, делецией 17p, другими цитогенетическими изменениями и клиническими характеристиками пациента формирует более точную оценку биологии опухолевого клона и риска прогрессирования. При этом IGHV характеризует стабильное свойство исходного В-клеточного клона, тогда как часть приобретённых генетических нарушений способна изменяться по мере эволюции заболевания.

Что влияет на результат

Низкая представленность клональных В-лимфоцитов в исследуемом образце может затруднять получение последовательности перестроенного IGHV. Для определения мутационного статуса необходимо амплифицировать клональную IGHV-IGHD-IGHJ-перестройку и получить последовательность, достаточную для сопоставления с герминальным IGHV-геном. При малом количестве опухолевых клеток выделение доминирующей клональной последовательности и её последующее секвенирование могут быть затруднены; такая ситуация возможна при небольшой опухолевой нагрузке или выраженном уменьшении клональной популяции после лечения. В отдельных случаях выявляются две продуктивные IGHV-IGHD-IGHJ-перестройки или несколько клональных последовательностей. Если выявленные перестройки различаются по степени соматической гипермутации, каждую из них необходимо оценивать отдельно. Несовпадающий мутационный статус нескольких клональных последовательностей усложняет однозначное отнесение исследуемого случая к мутированному или немутированному варианту и требует сопоставления всех полученных последовательностей с соответствующими герминальными генами.