МикозоСкрин. ПЦР-диагностика и типирование грибов рода Candida, Malassezia, Saccharomyces и Debaryomyces в крови, количественное исследование

Анализ выполняет количественное определение и видовое типирование 13 клинически значимых видов дрожжеподобных грибов в крови методом ПЦР. Кровь — стерильная среда, и грибы в ней в норме отсутствуют. Обнаружение любого из 13 включённых видов не отражает колонизацию или контаминацию: оно указывает на фунгемию, то есть на присутствие возбудителя в кровотоке, что является признаком инвазивной грибковой инфекции. Тест охватывает основные виды рода Candida в строгом таксономическом смысле (C. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. glabrata, C. parapsilosis), виды, исторически отнесённые к роду Candida, но переклассифицированные в современной таксономии в другие роды (Meyerozyma guilliermondii, Pichia kudriavzevii, Clavispora lusitaniae, Kluyveromyces marxianus), Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii, представителей рода Malassezia (Malassezia spp., M. furfur), а также Candida auris с особым клиническим значением.

Инвазивный кандидоз — одна из ведущих причин нозокомиальных инфекций кровотока в современных стационарах, особенно в реанимационных и онкологических отделениях. Кандидемия (присутствие Candida в крови) ассоциирована с высокой летальностью, существенно увеличивает длительность госпитализации и стоимость лечения. Группы повышенного риска инвазивного кандидоза — пациенты с длительной нейтропенией на фоне химиотерапии онкологических и онкогематологических заболеваний, реципиенты трансплантата (костного мозга, солидных органов), пациенты на длительной антибактериальной терапии широкого спектра, на парентеральном питании, с центральными венозными катетерами, после абдоминальных операций, в реанимационных ситуациях с тяжёлыми сопутствующими заболеваниями, новорождённые с очень низкой массой тела. У этих категорий ранняя диагностика инвазивной грибковой инфекции и видовая идентификация возбудителя имеют принципиальное значение для исхода.

Видовая принадлежность находки в крови имеет прямые клинические последствия. Candida albicans — наиболее частый возбудитель кандидемии, обычно сохраняющий чувствительность к стандартным противогрибковым препаратам. Candida tropicalis ассоциирован с агрессивным течением кандидемии у онкогематологических пациентов с нейтропенией, склонен к диссеминации; летальность высокая. Candida glabrata — второй по частоте возбудитель кандидемии в большинстве регионов с природно сниженной чувствительностью к флуконазолу и нарастающей устойчивостью к эхинокандинам, что меняет логику эмпирической терапии. Candida parapsilosis ассоциирован с катетер-ассоциированной кандидемией, особенно у новорождённых и на парентеральном питании; имеет сниженную чувствительность к эхинокандинам. Candida dubliniensis — менее частый возбудитель, чаще обнаруживаемый у ВИЧ-инфицированных пациентов. 
Виды, исторически отнесённые к роду Candida, в современной таксономии переклассифицированы. Pichia kudriavzevii (исторически Candida krusei) с природной устойчивостью к флуконазолу — клинически значимая находка у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и реципиентов трансплантата костного мозга, часто после длительной флуконазольной профилактики. Meyerozyma guilliermondii (исторически Candida guilliermondii) — реже встречающийся возбудитель катетер-ассоциированных инфекций у иммунокомпрометированных пациентов; имеет сниженную чувствительность к эхинокандинам и амфотерицину B. Clavispora lusitaniae (исторически Candida lusitaniae) — редкий возбудитель с природной устойчивостью к амфотерицину B. Kluyveromyces marxianus (исторически Candida kefyr) — редкий возбудитель фунгемии у иммунокомпрометированных пациентов. 
Candida auris — особо опасный возбудитель с самым тяжёлым клиническим профилем среди включённых в тест. Большинство клинических изолятов C. auris демонстрируют устойчивость к флуконазолу, значительная часть — сниженную чувствительность к другим азолам и амфотерицину B, описаны изоляты с устойчивостью к эхинокандинам. Кандидемия, вызванная C. auris, имеет высокую летальность, превышающую летальность при других видах Candida, и регистрировалась в рамках вспышек в реанимационных и кардиохирургических стационарах. Стандартными микробиологическими методами C. auris часто ошибочно идентифицируется как другие виды, что приводит к задержке адекватной терапии и недооценке распространённости возбудителя; молекулярная диагностика обеспечивает надёжную видовую идентификацию. 
Saccharomyces cerevisiae — описаны редкие случаи фунгемии у иммунокомпрометированных пациентов, в том числе после применения пробиотических препаратов с этим видом у пациентов с центральными венозными катетерами или с нарушением целостности кишечного барьера. Debaryomyces hansenii (исторически Candida famata) — редкий возбудитель фунгемии у иммунокомпрометированных пациентов и у новорождённых. 
Malassezia furfur и Malassezia spp. — редкие возбудители Malassezia-ассоциированной фунгемии. Особое значение имеют у новорождённых, особенно недоношенных с очень низкой массой тела, на парентеральном питании с липидными эмульсиями: Malassezia как липофильный организм использует липиды парентерального питания для размножения, и катетер-ассоциированная фунгемия в этой группе пациентов — описанная клиническая ситуация. У взрослых пациентов Malassezia-фунгемия встречается значительно реже, преимущественно при длительном парентеральном питании.

Стандартная лабораторная диагностика инвазивного кандидоза — культуральное исследование крови. Это эталонный метод, дающий изолят возбудителя для видовой идентификации и определения чувствительности к противогрибковым препаратам. ПЦР крови дополняет культуру и не заменяет её. Молекулярная диагностика обеспечивает более быстрый результат (часы против нескольких дней у культуры), сохраняет чувствительность у пациентов, уже получающих противогрибковую терапию (когда культура часто становится негативной), надёжно идентифицирует виды, ошибочно определяемые культуральными методами (прежде всего C. auris). Чувствительность ПЦР крови при инвазивных грибковых инфекциях ограничена: грибы в крови могут присутствовать в минимальных количествах, концентрация ДНК низкая, и отрицательный результат не исключает инвазивной инфекции, особенно при глубоких очагах с минимальным выходом возбудителя в кровоток.

Метод ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией выявляет видоспецифические участки генома каждого из 13 включённых видов с количественной оценкой содержания. Метод не зависит от жизнеспособности возбудителя, обнаруживает ДНК как живых, так и погибших клеток, что подходит для исследования у пациентов на противогрибковой терапии.

Клиническое значение

Тест применяется при подозрении на инвазивную грибковую инфекцию у пациентов из групп повышенного риска. Главные клинические ситуации — фебрильная нейтропения у онкогематологических пациентов, не отвечающая на эмпирическую антибактериальную терапию; необъяснимая лихорадка у пациентов с центральными венозными катетерами и на длительном парентеральном питании; подозрение на катетер-ассоциированную инфекцию кровотока с грибковой этиологией; неонатальный сепсис у недоношенных с очень низкой массой тела; подозрение на инвазивный кандидоз у пациентов в реанимации с тяжёлыми сопутствующими заболеваниями.

Тест применяется параллельно с культуральным исследованием крови как часть комплексной диагностики инвазивных грибковых инфекций. Клинически выгодная роль ПЦР — быстрый этиологический ответ на ранней стадии заболевания, когда культура ещё не созрела, а решение о начале или коррекции противогрибковой терапии нужно принимать срочно. У пациентов, уже получающих противогрибковую терапию, ПЦР сохраняет чувствительность, тогда как культура часто становится негативной.

Положительный результат на любой из 13 включённых видов указывает на присутствие соответствующего возбудителя в крови и поддерживает диагноз инвазивной грибковой инфекции. Видовая идентификация даёт лечащему врачу ориентир для оценки клинической ситуации с учётом известных особенностей вида (типичной клинической ниши, природной чувствительности или устойчивости к группам противогрибковых препаратов). Решение о терапии принимается лечащим врачом по совокупности клинических, микробиологических и лабораторных данных, при возможности с дополнительным культуральным подтверждением и определением индивидуальной чувствительности штамма.

Обнаружение C. auris в крови — крайне значимая находка, требующая немедленного информирования лечащего врача, эпидемиолога стационара и руководства лаборатории. Помимо индивидуального ведения пациента, это событие требует противоэпидемических мер для предотвращения распространения возбудителя в стационаре.

Отрицательный результат по всем 13 включённым видам снижает вероятность участия Candida и других включённых дрожжеподобных грибов в развитии инвазивной грибковой инфекции, но не исключает её. ПЦР крови имеет ограниченную чувствительность, и при сохраняющемся клиническом подозрении на инвазивный микоз обследование продолжается: повторная ПЦР, культура крови (включая повторные посевы), серологические маркеры (бета-D-глюкан как панфунгальный маркер, галактоманнан при подозрении на аспергиллёз), визуализационные исследования при подозрении на органные поражения, морфологическое исследование при доступности биоптатов.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Чувствительность ПЦР крови при инвазивных грибковых инфекциях ограничена: возбудители могут присутствовать в крови в минимальных количествах, и отрицательный результат не исключает инвазивной инфекции, особенно при глубоких очагах с минимальным выходом возбудителя в кровоток. Тест не заменяет культуральное исследование крови — эталонный метод диагностики инвазивного кандидоза с возможностью определения индивидуальной чувствительности штамма; ПЦР дополняет культуру, обеспечивая более быстрый результат и сохраняя чувствительность у пациентов на противогрибковой терапии. Тест не определяет индивидуальную чувствительность выявленного штамма к конкретным противогрибковым препаратам: известные особенности чувствительности отражают типичные видовые характеристики и могут служить ориентиром, но не заменяют культурального исследования с определением чувствительности при клинической необходимости. На результат влияет предшествующая противогрибковая терапия, снижающая количество возбудителя в крови. Качество биоматериала и преаналитика имеют значение: правильный забор крови с соблюдением асептики, использование подходящего антикоагулянта, своевременная доставка в лабораторию. Результат исследования требует интерпретации врачом — инфекционистом, реаниматологом, гематологом, онкологом, неонатологом — с учётом клинической картины, факторов риска инвазивного микоза, результатов культурального исследования крови и других сопутствующих исследований, состояния пациента и общей ситуации.