МикозоСкрин. ПЦР-диагностика и типирование грибов рода Candida, Malassezia, Saccharomyces и Debaryomyces в различных локациях, количественное исследование

Анализ выполняет количественное определение и видовое типирование грибков 13 клинически значимых видов методом ПЦР. Тест охватывает основной спектр клинически значимых дрожжеподобных грибов, встречающихся у человека: основные виды рода Candida в строгом таксономическом смысле, виды, исторически названные Candida, но переклассифицированные в современной таксономии в другие роды (Meyerozyma, Pichia, Clavispora, Kluyveromyces), Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii, представителей рода Malassezia, а также отдельный возбудитель Candida auris с особым клиническим значением.

Грибы рода Candida и родственные дрожжеподобные грибы — частые возбудители микозов человека, от поверхностных кандидозов слизистых до инвазивных форм с высокой летальностью у иммунокомпрометированных пациентов. Видовая идентификация имеет принципиальное практическое значение по нескольким причинам. 
Виды существенно различаются по чувствительности к противогрибковым препаратам. Стандартная эмпирическая терапия кандидоза обычно строится на флуконазоле, активном против C. albicans, однако ряд non-albicans видов имеет природно сниженную чувствительность или полную устойчивость к этому препарату. При обнаружении такого возбудителя стандартная эмпирическая схема может оказаться недостаточно эффективной. 
Виды различаются по типичным клиническим нишам и группам пациентов. Одни возбудители ассоциированы с поверхностными микозами слизистых у иммунокомпетентных людей, другие — с тяжёлыми инвазивными инфекциями у пациентов с иммуносупрессией, третьи — с катетер-ассоциированными инфекциями, четвёртые — с инфекциями у новорождённых. Биология видов отражается на устойчивости к различным препаратам и на склонности к биоплёнкообразованию, что важно учитывать в стационарной практике, при работе с медицинскими изделиями, в реанимационных ситуациях.

Состав панели

Candida albicans — основной и наиболее распространённый возбудитель кандидозов у человека. На его долю приходится большинство клинически значимых случаев, в том числе вульвовагинального кандидоза, орофарингеального кандидоза, кожного кандидоза, кандидозного эзофагита у иммунокомпрометированных, значительная часть инвазивных форм. Биологическая особенность вида — способность к морфологическому переходу между дрожжевой формой и формой гиф, что лежит в основе его патогенного потенциала. Вид сохраняет чувствительность к стандартным противогрибковым препаратам — флуконазолу, эхинокандинам, амфотерицину B.

Candida tropicalis — вид с агрессивным клиническим поведением и тенденцией к диссеминации при инвазивных формах. Типичная клиническая ниша — онкогематологические пациенты, особенно с нейтропенией на фоне химиотерапии, у которых вид часто становится причиной кандидемии и диссеминированного кандидоза с высокой летальностью. Распространён шире в тропических и субтропических регионах. Чувствительность к стандартным противогрибковым препаратам в большинстве случаев сохраняется, но скорость прогрессирования инфекции делает раннее выявление возбудителя важным условием своевременной терапии.

Candida dubliniensis — вид, морфологически и фенотипически очень близкий к C. albicans, что в прошлом приводило к их смешиванию в культуральной диагностике. Молекулярная идентификация позволяет надёжно их разграничивать. Клинически C. dubliniensis чаще встречается у ВИЧ-инфицированных пациентов с орофарингеальным кандидозом, реже вызывает инвазивные формы. Чувствительность к флуконазолу у C. dubliniensis обычно сохраняется, но описано более частое, чем у C. albicans, развитие приобретённой устойчивости при длительной терапии азолами.

Candida glabrata — второй по частоте возбудитель кандидозов в большинстве регионов, его доля в инвазивных формах в последние десятилетия растёт. Биологически вид отличается от C. albicans отсутствием гифообразования: существует только в дрожжевой форме. Чаще обнаруживается у пожилых пациентов, у пациентов с сахарным диабетом, в реанимационных и онкологических отделениях, при рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. Главная клиническая особенность вида — природно сниженная чувствительность к флуконазолу с тенденцией к развитию приобретённой устойчивости при длительной терапии азолами; описана и нарастающая устойчивость к эхинокандинам.

Candida parapsilosis — вид с особым клиническим профилем, связанным с выраженной способностью к биоплёнкообразованию на медицинских изделиях. Типичные клинические ниши — катетер-ассоциированные инфекции кровотока, инфекции у пациентов на длительном парентеральном питании, у пациентов с протезированными клапанами сердца, в отделениях интенсивной терапии. Особое место C. parapsilosis занимает в неонатологии: у новорождённых с очень низкой массой тела этот вид — один из ведущих возбудителей неонатального кандидоза. Чувствительность к флуконазолу обычно сохраняется, но имеется сниженная чувствительность к эхинокандинам.

Candida auris — отдельный возбудитель с особым клиническим значением, относительно новый клинически значимый возбудитель, идентифицированный в 2009 году в Японии, с глобальным распространением начиная с 2010-х годов. Его выделение в самостоятельный показатель теста обусловлено уникальным сочетанием клинических характеристик, отличающих его от других видов рода Candida:

• Множественная устойчивость к противогрибковым препаратам. Большинство клинических изолятов C. auris демонстрируют устойчивость к флуконазолу, значительная часть — сниженную чувствительность к другим азолам и амфотерицину B, описаны изоляты с устойчивостью к эхинокандинам. Это делает C. auris одним из наиболее проблемных грибковых патогенов современности.
• Способность вызывать инвазивные инфекции с высокой летальностью. C. auris ассоциирован прежде всего с кандидемией и инвазивным кандидозом у тяжёлых пациентов в реанимации, у пациентов с иммуносупрессией, у пациентов на длительном пребывании в стационаре. Летальность при кандидемии, вызванной C. auris, существенна и превышает летальность при других видах Candida.
• Способность формировать вспышки в стационарах. C. auris эффективно колонизирует кожу и медицинские изделия, длительно сохраняется на поверхностях, передаётся между пациентами при недостаточном инфекционном контроле. Описаны вспышки в реанимационных отделениях, кардиохирургических и онкологических стационарах. Это делает выявление C. auris не только индивидуальной диагностической находкой, но и эпидемиологически значимым событием, требующим противоэпидемических мер.
• Сложности идентификации стандартными микробиологическими методами. C. auris часто ошибочно идентифицируется культуральными методами как другие виды (C. haemulonii, C. famata, родственные виды), что приводит к недооценке распространённости возбудителя и задержке адекватной терапии. Молекулярная диагностика обеспечивает надёжную видовую идентификацию.

Meyerozyma guilliermondii (исторически Candida guilliermondii) — менее распространённый возбудитель, чаще встречающийся у иммунокомпрометированных пациентов, при катетер-ассоциированных инфекциях, у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями. Имеет сниженную чувствительность к эхинокандинам и амфотерицину B.

Pichia kudriavzevii (исторически Candida krusei) — вид с природной устойчивостью к флуконазолу, что делает его обнаружение принципиально важным для понимания клинической ситуации. Эмпирическая флуконазольная схема при инфекциях этим видом не работает. Типичная клиническая ниша — пациенты с гематологическими злокачественными новообразованиями, реципиенты трансплантата костного мозга, пациенты после длительной флуконазольной профилактики, на фоне которой C. krusei становится преимущественной грибковой флорой.

Clavispora lusitaniae (исторически Candida lusitaniae) — менее распространённый вид с выраженной природной устойчивостью к амфотерицину B, что отличает его от большинства других кандид. Чаще встречается у иммунокомпрометированных пациентов и в инфекциях, связанных с медицинскими изделиями.

Kluyveromyces marxianus (исторически Candida kefyr) — редкий возбудитель, встречающийся у иммунокомпрометированных пациентов, в продуктах питания (кисломолочные продукты, кефир — отсюда историческое название). Клиническая значимость находки в нестерильных биоматериалах требует осторожной интерпретации с учётом клинической картины.

Saccharomyces cerevisiae — пекарские и пивные дрожжи, исторически считавшиеся непатогенными. В последние десятилетия описаны редкие случаи фунгемии и инвазивных инфекций, преимущественно у иммунокомпрометированных пациентов и пациентов на парентеральном питании. В нестерильных биоматериалах находка чаще отражает контаминацию пищевыми источниками или преходящее носительство.

Debaryomyces hansenii (исторически Candida famata) — комменсал, встречающийся на коже и в продуктах питания, с ограниченным патогенным потенциалом. Клинически значимые инфекции описаны у иммунокомпрометированных пациентов и у новорождённых.

Malassezia spp. и Malassezia furfur — представители рода Malassezia, основная клиническая ниша которого — кожная патология (отрубевидный лишай, себорейный дерматит, питироспоральный фолликулит). Malassezia — липофильные дрожжи, нуждающиеся в липидах для размножения, что отражается на их природных местах обитания (кожа и волосистая часть головы). В респираторных и других нестерильных биоматериалах вне кожи их обнаружение обычно отражает контаминацию или преходящее носительство и интерпретируется с осторожностью. Описаны редкие случаи Malassezia-ассоциированной фунгемии у новорождённых на парентеральном питании с липидными эмульсиями.

Показатель КВМ оценивает количество геномной ДНК человека в пробе и подтверждает адекватность забора. Низкий КВМ означает, что в пробе мало клеточного материала, и отрицательные результаты при таких условиях не могут рассматриваться как надёжные. Рекомендуется повторный забор материала.

Клиническое значение

Тест применяется как описательный инструмент оценки микологического спектра в нестерильных биоматериалах с акцентом на видовую идентификацию.

При обследовании пациентов с клинической картиной, подозрительной на грибковое поражение слизистых, дыхательных путей, желудочно-кишечного и урогенитального тракта, особенно при упорном или рецидивирующем течении, при неэффективности первичной терапии, у иммунокомпрометированных пациентов. Видовая идентификация даёт лечащему врачу ориентир для оценки клинической ситуации с учётом известных особенностей вида (типичной клинической ниши, природной чувствительности или устойчивости к группам противогрибковых препаратов). Решение о терапии принимается лечащим врачом по совокупности клинических и лабораторных данных, при необходимости с дополнительным культуральным подтверждением и определением индивидуальной чувствительности штамма.

При обследовании пациентов с факторами риска инвазивного кандидоза — после длительных абдоминальных операций, при центральных венозных катетерах, на длительной антибактериальной терапии широкого спектра, на парентеральном питании, в реанимационных ситуациях. Сам тест выполняется на нестерильных биоматериалах и не предназначен для диагностики кандидемии (для которой требуется исследование крови). Однако выявление потенциально инвазивных видов в нестерильных локусах может сигнализировать о повышенном риске и быть основанием для целенаправленного обследования.

Обнаружение C. auris в любом из исследуемых биоматериалов — клинически и эпидемиологически значимая находка. Раннее выявление возбудителя важно как для индивидуального ведения пациента, так и для своевременного информирования лечащего врача и эпидемиолога стационара. При этом стандартный регламентированный скрининг колонизации C. auris в международных рекомендациях (CDC и других) выполняется с использованием комбинированного мазка из подмышечной и паховой областей; нестерильные биоматериалы, входящие в охват МикозоСкрина (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, мазки из дыхательных путей, моча, кал и другие), не равнозначны такому стандартному скрининговому забору и используются по другим клиническим показаниям. Если стоит задача целевого скрининга колонизации C. auris, выполняется отдельное исследование с регламентированным забором материала.

Положительный результат на любой из включённых видов подтверждает присутствие соответствующего возбудителя в исследованной пробе с указанием количественной нагрузки. Значимость находки определяется в совокупности видовой принадлежностью, количественной выраженностью, типом биоматериала и состоянием пациента. Известные особенности чувствительности конкретного вида к противогрибковым препаратам — общая информация, которая может ориентировать лечащего врача, но не заменяет индивидуальной оценки штамма культуральными методами при клинической необходимости. Тактика ведения определяется лечащим врачом — инфекционистом, реаниматологом, гематологом, онкологом, гинекологом, оториноларингологом, пульмонологом — в зависимости от выявленного вида, локализации и клинической картины.

Отрицательный результат по всем 13 включённым видам снижает вероятность участия Candida и других включённых дрожжеподобных грибов в развитии симптомов или процесса в исследованной локализации. Отрицательный результат не исключает других, более редких грибковых возбудителей (плесневых грибов, Pneumocystis jirovecii, дерматофитов, эндемичных микозов), для диагностики которых выполняются отдельные исследования.

Что влияет на результат

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Биоматериалы из нестерильных локализаций естественно содержат микрофлору, в составе которой может присутствовать Candida как часть колонизации без участия в развитии заболевания. Тест не определяет индивидуальную чувствительность выявленного штамма к конкретным противогрибковым препаратам: известные особенности чувствительности отражают типичные видовые характеристики и могут служить ориентиром, но не заменяют культурального исследования с определением чувствительности при клинической необходимости. ПЦР из нестерильных биоматериалов не используется как самостоятельный инструмент контроля эффективности противогрибковой терапии: динамика терапии оценивается по совокупности клинических и лабораторных данных. На результат влияет предшествующая противогрибковая терапия, снижающая количество возбудителя в пробе. Качество забора материала имеет значение для результата. Результат исследования требует интерпретации врачом с учётом локализации забора материала, клинической картины, факторов риска грибковой инфекции, состояния пациента и общей ситуации.