МикозоСкрин. ПЦР-диагностика и типирование грибов рода Candida, Malassezia, Saccharomyces и Debaryomyces в различных локациях, количественное исследование

Анализ выполняет количественное определение и видовое типирование грибков 13 клинически значимых видов методом ПЦР. Тест охватывает основной спектр клинически значимых дрожжеподобных грибов, встречающихся у человека: основные виды рода Candida в строгом таксономическом смысле, виды, исторически названные Candida, но переклассифицированные в современной таксономии в другие роды (Meyerozyma, Pichia, Clavispora, Kluyveromyces), Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii, представителей рода Malassezia, а также отдельный возбудитель Candida auris с особым клиническим значением.

Грибы рода Candida и родственные дрожжеподобные грибы — частые возбудители микозов человека, от поверхностных кандидозов слизистых до инвазивных форм с высокой летальностью у иммунокомпрометированных пациентов. Видовая идентификация имеет принципиальное практическое значение по нескольким причинам. 
Виды существенно различаются по чувствительности к противогрибковым препаратам. Стандартная эмпирическая терапия кандидоза обычно строится на флуконазоле, активном против C. albicans, однако ряд non-albicans видов имеет природно сниженную чувствительность или полную устойчивость к этому препарату. При обнаружении такого возбудителя стандартная эмпирическая схема может оказаться недостаточно эффективной. 
Виды различаются по типичным клиническим нишам и группам пациентов. Одни возбудители ассоциированы с поверхностными микозами слизистых у иммунокомпетентных людей, другие — с тяжёлыми инвазивными инфекциями у пациентов с иммуносупрессией, третьи — с катетер-ассоциированными инфекциями, четвёртые — с инфекциями у новорождённых. Биология видов отражается на устойчивости к различным препаратам и на склонности к биоплёнкообразованию, что важно учитывать в стационарной практике, при работе с медицинскими изделиями, в реанимационных ситуациях.

Состав панели

Candida albicans — основной и наиболее распространённый возбудитель кандидозов у человека. На его долю приходится большинство клинически значимых случаев, в том числе вульвовагинального кандидоза, орофарингеального кандидоза, кожного кандидоза, кандидозного эзофагита у иммунокомпрометированных, значительная часть инвазивных форм. Биологическая особенность вида — способность к морфологическому переходу между дрожжевой формой и формой гиф, что лежит в основе его патогенного потенциала. Вид сохраняет чувствительность к стандартным противогрибковым препаратам — флуконазолу, эхинокандинам, амфотерицину B.

Candida tropicalis — вид с агрессивным клиническим поведением и тенденцией к диссеминации при инвазивных формах. Типичная клиническая ниша — онкогематологические пациенты, особенно с нейтропенией на фоне химиотерапии, у которых вид часто становится причиной кандидемии и диссеминированного кандидоза с высокой летальностью. Распространён шире в тропических и субтропических регионах. Чувствительность к стандартным противогрибковым препаратам в большинстве случаев сохраняется, но скорость прогрессирования инфекции делает раннее выявление возбудителя важным условием своевременной терапии.

Candida dubliniensis — вид, морфологически и фенотипически очень близкий к C. albicans, что в прошлом приводило к их смешиванию в культуральной диагностике. Молекулярная идентификация позволяет надёжно их разграничивать. Клинически C. dubliniensis чаще встречается у ВИЧ-инфицированных пациентов с орофарингеальным кандидозом, реже вызывает инвазивные формы. Чувствительность к флуконазолу у C. dubliniensis обычно сохраняется, но описано более частое, чем у C. albicans, развитие приобретённой устойчивости при длительной терапии азолами.

Candida glabrata — второй по частоте возбудитель кандидозов в большинстве регионов, его доля в инвазивных формах в последние десятилетия растёт. Биологически вид отличается от C. albicans отсутствием гифообразования: существует только в дрожжевой форме. Чаще обнаруживается у пожилых пациентов, у пациентов с сахарным диабетом, в реанимационных и онкологических отделениях, при рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. Главная клиническая особенность вида — природно сниженная чувствительность к флуконазолу с тенденцией к развитию приобретённой устойчивости при длительной терапии азолами; описана и нарастающая устойчивость к эхинокандинам.

Candida parapsilosis — вид с особым клиническим профилем, связанным с выраженной способностью к биоплёнкообразованию на медицинских изделиях. Типичные клинические ниши — катетер-ассоциированные инфекции кровотока, инфекции у пациентов на длительном парентеральном питании, у пациентов с протезированными клапанами сердца, в отделениях интенсивной терапии. Особое место C. parapsilosis занимает в неонатологии: у новорождённых с очень низкой массой тела этот вид — один из ведущих возбудителей неонатального кандидоза. Чувствительность к флуконазолу обычно сохраняется, но имеется сниженная чувствительность к эхинокандинам.

Candida auris — отдельный возбудитель с особым клиническим значением, относительно новый клинически значимый возбудитель, идентифицированный в 2009 году в Японии, с глобальным распространением начиная с 2010-х годов. Его выделение в самостоятельный показатель теста обусловлено уникальным сочетанием клинических характеристик, отличающих его от других видов рода Candida:

• Множественная устойчивость к противогрибковым препаратам. Большинство клинических изолятов C. auris демонстрируют устойчивость к флуконазолу, значительная часть — сниженную чувствительность к другим азолам и амфотерицину B, описаны изоляты с устойчивостью к эхинокандинам. Это делает C. auris одним из наиболее проблемных грибковых патогенов современности.
• Способность вызывать инвазивные инфекции с высокой летальностью. C. auris ассоциирован прежде всего с кандидемией и инвазивным кандидозом у тяжёлых пациентов в реанимации, у пациентов с иммуносупрессией, у пациентов на длительном пребывании в стационаре. Летальность при кандидемии, вызванной C. auris, существенна и превышает летальность при других видах Candida.
• Способность формировать вспышки в стационарах. C. auris эффективно колонизирует кожу и медицинские изделия, длительно сохраняется на поверхностях, передаётся между пациентами при недостаточном инфекционном контроле. Описаны вспышки в реанимационных отделениях, кардиохирургических и онкологических стационарах. Это делает выявление C. auris не только индивидуальной диагностической находкой, но и эпидемиологически значимым событием, требующим противоэпидемических мер.
• Сложности идентификации стандартными микробиологическими методами. C. auris часто ошибочно идентифицируется культуральными методами как другие виды (C. haemulonii, C. famata, родственные виды), что приводит к недооценке распространённости возбудителя и задержке адекватной терапии. Молекулярная диагностика обеспечивает надёжную видовую идентификацию.

Meyerozyma guilliermondii (исторически Candida guilliermondii) — менее распространённый возбудитель, чаще встречающийся у иммунокомпрометированных пациентов, при катетер-ассоциированных инфекциях, у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями. Имеет сниженную чувствительность к эхинокандинам и амфотерицину B.

Pichia kudriavzevii (исторически Candida krusei) — вид с природной устойчивостью к флуконазолу, что делает его обнаружение принципиально важным для понимания клинической ситуации. Эмпирическая флуконазольная схема при инфекциях этим видом не работает. Типичная клиническая ниша — пациенты с гематологическими злокачественными новообразованиями, реципиенты трансплантата костного мозга, пациенты после длительной флуконазольной профилактики, на фоне которой C. krusei становится преимущественной грибковой флорой.

Clavispora lusitaniae (исторически Candida lusitaniae) — менее распространённый вид с выраженной природной устойчивостью к амфотерицину B, что отличает его от большинства других кандид. Чаще встречается у иммунокомпрометированных пациентов и в инфекциях, связанных с медицинскими изделиями.

Kluyveromyces marxianus (исторически Candida kefyr) — редкий возбудитель, встречающийся у иммунокомпрометированных пациентов, в продуктах питания (кисломолочные продукты, кефир — отсюда историческое название). Клиническая значимость находки в нестерильных биоматериалах требует осторожной интерпретации с учётом клинической картины.

Saccharomyces cerevisiae — пекарские и пивные дрожжи, исторически считавшиеся непатогенными. В последние десятилетия описаны редкие случаи фунгемии и инвазивных инфекций, преимущественно у иммунокомпрометированных пациентов и пациентов на парентеральном питании. В нестерильных биоматериалах находка чаще отражает контаминацию пищевыми источниками или преходящее носительство.

Debaryomyces hansenii (исторически Candida famata) — комменсал, встречающийся на коже и в продуктах питания, с ограниченным патогенным потенциалом. Клинически значимые инфекции описаны у иммунокомпрометированных пациентов и у новорождённых.

Malassezia spp. и Malassezia furfur — представители рода Malassezia, основная клиническая ниша которого — кожная патология (отрубевидный лишай, себорейный дерматит, питироспоральный фолликулит). Malassezia — липофильные дрожжи, нуждающиеся в липидах для размножения, что отражается на их природных местах обитания (кожа и волосистая часть головы). В респираторных и других нестерильных биоматериалах вне кожи их обнаружение обычно отражает контаминацию или преходящее носительство и интерпретируется с осторожностью. Описаны редкие случаи Malassezia-ассоциированной фунгемии у новорождённых на парентеральном питании с липидными эмульсиями.

Показатель КВМ оценивает количество геномной ДНК человека в пробе и подтверждает адекватность забора. Низкий КВМ означает, что в пробе мало клеточного материала, и отрицательные результаты при таких условиях не могут рассматриваться как надёжные. Рекомендуется повторный забор материала.

Клиническое значение

Тест применяется как описательный инструмент оценки микологического спектра в нестерильных биоматериалах с акцентом на видовую идентификацию.

При обследовании пациентов с клинической картиной, подозрительной на грибковое поражение слизистых, дыхательных путей, желудочно-кишечного и урогенитального тракта, особенно при упорном или рецидивирующем течении, при неэффективности первичной терапии, у иммунокомпрометированных пациентов. Видовая идентификация даёт лечащему врачу ориентир для оценки клинической ситуации с учётом известных особенностей вида (типичной клинической ниши, природной чувствительности или устойчивости к группам противогрибковых препаратов). Решение о терапии принимается лечащим врачом по совокупности клинических и лабораторных данных, при необходимости с дополнительным культуральным подтверждением и определением индивидуальной чувствительности штамма.

При обследовании пациентов с факторами риска инвазивного кандидоза — после длительных абдоминальных операций, при центральных венозных катетерах, на длительной антибактериальной терапии широкого спектра, на парентеральном питании, в реанимационных ситуациях. Сам тест выполняется на нестерильных биоматериалах и не предназначен для диагностики кандидемии (для которой требуется исследование крови). Однако выявление потенциально инвазивных видов в нестерильных локусах может сигнализировать о повышенном риске и быть основанием для целенаправленного обследования.

Обнаружение C. auris в любом из исследуемых биоматериалов — клинически и эпидемиологически значимая находка. Раннее выявление возбудителя важно как для индивидуального ведения пациента, так и для своевременного информирования лечащего врача и эпидемиолога стационара. При этом стандартный регламентированный скрининг колонизации C. auris в международных рекомендациях (CDC и других) выполняется с использованием комбинированного мазка из подмышечной и паховой областей; нестерильные биоматериалы, входящие в охват МикозоСкрина (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, мазки из дыхательных путей, моча, кал и другие), не равнозначны такому стандартному скрининговому забору и используются по другим клиническим показаниям. Если стоит задача целевого скрининга колонизации C. auris, выполняется отдельное исследование с регламентированным забором материала.

Положительный результат на любой из включённых видов подтверждает присутствие соответствующего возбудителя в исследованной пробе с указанием количественной нагрузки. Значимость находки определяется в совокупности видовой принадлежностью, количественной выраженностью, типом биоматериала и состоянием пациента. Известные особенности чувствительности конкретного вида к противогрибковым препаратам — общая информация, которая может ориентировать лечащего врача, но не заменяет индивидуальной оценки штамма культуральными методами при клинической необходимости. Тактика ведения определяется лечащим врачом — инфекционистом, реаниматологом, гематологом, онкологом, гинекологом, оториноларингологом, пульмонологом — в зависимости от выявленного вида, локализации и клинической картины.

Отрицательный результат по всем 13 включённым видам снижает вероятность участия Candida и других включённых дрожжеподобных грибов в развитии симптомов или процесса в исследованной локализации. Отрицательный результат не исключает других, более редких грибковых возбудителей (плесневых грибов, Pneumocystis jirovecii, дерматофитов, эндемичных микозов), для диагностики которых выполняются отдельные исследования.

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Биоматериалы из нестерильных локализаций естественно содержат микрофлору, в составе которой может присутствовать Candida как часть колонизации без участия в развитии заболевания. Из-за этого молекулярное обнаружение Candida не разграничивает колонизацию и активную инфекцию автоматически; интерпретация требует учёта клинической картины и состояния пациента. Количественная оценка содержания возбудителя помогает в этой интерпретации, но универсальные количественные пороги для разграничения колонизации и инфекции разработаны не для всех биоматериалов. Тест не определяет индивидуальную чувствительность выявленного штамма к конкретным противогрибковым препаратам: известные особенности чувствительности отражают типичные видовые характеристики и могут служить ориентиром, но не заменяют культурального исследования с определением чувствительности при клинической необходимости. ПЦР из нестерильных биоматериалов не используется как самостоятельный инструмент контроля эффективности противогрибковой терапии: динамика терапии оценивается по совокупности клинических и лабораторных данных. На результат влияет предшествующая противогрибковая терапия, снижающая количество возбудителя в пробе. Качество забора материала имеет значение для результата. Результат исследования требует интерпретации врачом с учётом локализации забора материала, клинической картины, факторов риска грибковой инфекции, состояния пациента и общей ситуации.