ПЦР-диагностика РНК вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 (HIV-1) в крови, количественно

Исследование измеряет количество вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в крови. Результат показывает вирусную нагрузку — ключевой показатель активности инфекции и эффективности лечения. 
Методом ПЦР в сыворотке крови определяется концентрация РНК вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1, Human immunodeficiency virus, HIV-1). Результат выражается в международных единицах на миллилитр (МЕ/мл). Чувствительность определения составляет 80 МЕ/мл (тест-система РеалБест ВИЧ ПЦР). Это означает, что вирусная нагрузка ниже 80 МЕ/мл не поддаётся количественной оценке данным методом и будет интерпретирована как неопределяемая. В отличие от качественного ПЦР-теста (который отвечает на вопрос «есть ли вирус в крови?»), количественное исследование определяет уровень виремии — концентрацию вирусных частиц в единице объёма крови. Основное назначение количественной ПЦР — мониторинг течения ВИЧ-инфекции и оценка эффективности антиретровирусной терапии (АРТ). Рутинный скрининг ВИЧ-инфекции в общей популяции проводится серологическими методами (тесты 4-го поколения, определяющие одновременно антитела и антиген p24), а не ПЦР.

ВИЧ-1 — РНК-содержащий ретровирус семейства Retroviridae, подсемейства Lentivirinae. Вирус поражает преимущественно CD4+ Т-лимфоциты — ключевые клетки иммунной системы, координирующие иммунный ответ. Без лечения прогрессирующее снижение числа CD4+ клеток приводит к развитию синдрома приобретённого иммунодефицита (СПИД), характеризующегося тяжёлыми оппортунистическими инфекциями и злокачественными новообразованиями. ВИЧ-1 подразделяется на группы M, N, O и P; группа M (major) ответственна за подавляющее большинство случаев пандемии и включает множество подтипов (A, B, C, D, F, G и рекомбинантные формы), распространённых в различных регионах мира. На территории Российской Федерации доминирует подтип A6 (ранее A1) и рекомбинантная форма CRF63_02A6.

Вирус передаётся при незащищённых половых контактах (вагинальных, анальных, орально-генитальных), через контаминированные кровью инструменты (инъекционные иглы, медицинский инструментарий), при переливании инфицированной крови и от матери к ребёнку во время беременности, родов и грудного вскармливания. После инфицирования вирус интегрирует свой геном в ДНК клеток хозяина, формируя провирусный резервуар, что делает полную элиминацию вируса из организма невозможной при нынешнем уровне терапии. Острая ВИЧ-инфекция развивается через 2–4 недели после заражения и проявляется гриппоподобным синдромом (лихорадка, фарингит, лимфаденопатия, сыпь, миалгии); в этот период вирусная нагрузка достигает очень высоких значений, а риск передачи максимален. После сероконверсии наступает бессимптомная фаза, которая без лечения может продолжаться годы, однако вирус продолжает реплицироваться, и количество CD4+ клеток постепенно снижается.

Современная антиретровирусная терапия позволяет подавить репликацию ВИЧ до неопределяемого уровня у подавляющего большинства пациентов, получающих лечение. Достижение и поддержание неопределяемой вирусной нагрузки (<200 копий/мл по определению CDC) означает, что риск половой передачи ВИЧ практически равен нулю — принцип «Н=Н» (неопределяемый = непередаваемый, U=U — Undetectable = Untransmittable), подтверждённый крупными клиническими исследованиями HPTN 052, PARTNER и PARTNER2.

Клиническое значение

Количественное определение РНК ВИЧ-1 (вирусная нагрузка) является основным лабораторным инструментом мониторинга ВИЧ-инфекции и оценки эффективности АРТ. В совокупности с подсчётом CD4+ Т-лимфоцитов вирусная нагрузка формирует два ключевых параметра, на которых строится клиническое ведение пациента с ВИЧ-инфекцией. Базовый уровень вирусной нагрузки, определённый до начала терапии, служит точкой отсчёта для оценки ответа на лечение. Целью АРТ является достижение неопределяемой вирусной нагрузки в течение 3–6 месяцев от начала терапии; устойчивое подавление виремии ниже порога определения тест-системы подтверждает эффективность выбранной схемы.

Мониторинг вирусной нагрузки в ходе терапии позволяет своевременно выявить вирусологическую неудачу. Согласно рекомендациям DHHS (Министерство здравоохранения США), вирусологическая неудача определяется как подтверждённая вирусная нагрузка выше 200 копий/мл на фоне АРТ. Причинами могут быть недостаточная приверженность терапии, лекарственные взаимодействия, нарушения всасывания или формирование резистентности вируса к препаратам. Раннее обнаружение вирусологической неудачи — до клинического ухудшения и иммунологического прогрессирования — позволяет врачу своевременно скорректировать схему лечения, назначить исследование резистентности и предотвратить накопление мутаций. Минимально значимым изменением вирусной нагрузки считается трёхкратное (0,5 log₁₀) отклонение; колебания в пределах этого диапазона могут отражать биологическую вариабельность и не обязательно свидетельствуют о неэффективности терапии.

На фоне успешной АРТ у части пациентов наблюдаются так называемые «вирусные всплески» (blips) — кратковременные эпизоды выявления низких уровней РНК ВИЧ (обычно 20–200 копий/мл), которые при повторном тестировании возвращаются к неопределяемым значениям. Изолированные всплески, как правило, не свидетельствуют о вирусологической неудаче и не требуют изменения терапии, но при повторяющихся или нарастающих эпизодах необходимо оценить приверженность лечению и рассмотреть исследование резистентности.

Помимо мониторинга терапии, количественная ПЦР применяется при первичном обследовании пациента с установленным диагнозом ВИЧ-инфекции для определения базовой вирусной нагрузки. Высокий уровень виремии (>100 000 копий/мл) ассоциирован с более быстрым прогрессированием заболевания и может влиять на выбор стартовой схемы АРТ. В акушерской практике мониторинг вирусной нагрузки у беременных женщин с ВИЧ-инфекцией определяет тактику ведения беременности и родоразрешения: достижение неопределяемой виремии к моменту родов существенно снижает риск вертикальной передачи. У детей, рождённых от матерей с ВИЧ-инфекцией, серологические методы неинформативны в первые 18 месяцев жизни из-за присутствия материнских антител, и количественная ПЦР (наряду с качественной) используется для ранней диагностики перинатальной ВИЧ-инфекции.

Исследование также может быть информативно при подозрении на острую ВИЧ-инфекцию, когда антитела ещё не выработались (серонегативное окно). В период острой инфекции вирусная нагрузка достигает чрезвычайно высоких значений; обнаружение РНК ВИЧ-1 при отрицательных или неопределённых серологических тестах может указывать на раннюю инфекцию. Однако для этой цели предпочтительны тесты 4-го поколения (одновременное определение антител и антигена p24), а количественная ПЦР не является стандартным методом скрининга и может давать ложноположительные результаты при низких значениях виремии у неинфицированных лиц.

Рекомендуемая частота мониторинга вирусной нагрузки: перед началом АРТ (базовый уровень), через 4–8 недель после начала или изменения схемы терапии, далее каждые 3–4 месяца в первый год и каждые 6 месяцев при стабильной вирусной супрессии. Для корректного динамического сравнения результатов рекомендуется использовать одну и ту же тест-систему, поскольку численные значения могут различаться между методами.

Таким образом, количественное определение РНК ВИЧ-1 наиболее информативно для мониторинга эффективности АРТ (основная область применения), для определения базовой вирусной нагрузки перед началом терапии, для мониторинга виремии у беременных с ВИЧ-инфекцией, для ранней диагностики у новорождённых и при подозрении на острую ВИЧ-инфекцию. Исследование не предназначено для скрининга ВИЧ-инфекции в общей популяции — для этого применяются серологические методы (ИФА/ИХЛА 4-го поколения с подтверждением иммуноблотом).

Ограничения

Количественный результат отражает уровень виремии в момент забора крови и не позволяет судить о состоянии латентного провирусного резервуара — вирусной ДНК, интегрированной в геном клеток хозяина. Неопределяемая вирусная нагрузка на фоне АРТ не означает элиминации вируса из организма; при прекращении терапии виремия возобновляется. 
Тест-система РеалБест ВИЧ ПЦР имеет нижний порог количественного определения 80 МЕ/мл. Результаты ниже этого порога сообщаются как «не обнаружено» или «менее 80 МЕ/мл» и не означают полного отсутствия вируса — возможна виремия ниже предела чувствительности метода. 
Результат зависит от преаналитических условий: время от забора крови до центрифугирования и отделения сыворотки, температура транспортировки и хранения образца влияют на сохранность РНК. Нарушение условий может привести к заниженным значениям вирусной нагрузки. 
Для динамического мониторинга рекомендуется использовать одну и ту же тест-систему на протяжении всего периода наблюдения. Результаты, полученные разными методами, могут различаться численно, что затрудняет сопоставление. Минимально значимым изменением вирусной нагрузки считается трёхкратное (0,5 log₁₀) отклонение; колебания меньшей амплитуды находятся в пределах биологической и аналитической вариабельности. 
Ложноположительные результаты описаны у пациентов, получавших CAR-T-клеточную терапию с использованием лентивирусных векторов, которые могут перекрёстно реагировать с мишенями тест-системы. 
Результат исследования требует интерпретации врачом-инфекционистом в совокупности с клинической картиной, уровнем CD4+ Т-лимфоцитов, данными о приверженности терапии, результатами исследования резистентности (при наличии) и анамнестическими данными.