Определение Ki-67 иммуногистохимическим методом: оценка пролиферативной активности опухоли (парафиновый блок)

При выявлении злокачественного новообразования одной из первоочередных задач становится оценка его агрессивности – способности к быстрому росту, инвазии в окружающие ткани и метастазированию. Два морфологически сходных опухолевых очага могут принципиально различаться по темпам роста, склонности к метастазированию и чувствительности к терапии. Эти различия в значительной мере обусловлены пролиферативной активностью опухолевой популяции, то есть долей клеток, которые в данный момент находятся в состоянии активного деления. Определение индекса пролиферативной активности по экспрессии белка Ki-67 является одним из наиболее информативных и универсальных методов объективной количественной оценки этого параметра.
Спектр клинического применения Ki-67 охватывает практически все основные нозологические группы в онкологии: рак молочной железы, нейроэндокринные новообразования, лимфопролиферативные заболевания, глиальные опухоли центральной нервной системы, саркомы мягких тканей, рак предстательной железы, опухоли желудочно-кишечного тракта. Подобная широта применения выделяет Ki-67 среди прочих иммуногистохимических маркеров: немногие из них сохраняют клиническую значимость вне зависимости от локализации и гистогенеза новообразования.

Биологический смысл маркера

Ki-67 – это ядерный антиген, впервые описанный Gerdes и соавторами в 1983 году при изучении клеток лимфомы Ходжкина. Молекула представляет собой димер, образованный двумя полипептидными цепями с молекулярной массой 345 и 395 кДа, и кодируется геном MKI67, локализованным на 10-й хромосоме. Он входит в структуру клеточного ядра в период между делениями и ассоциируется с хромосомами во время митоза.  Точная биологическая функция этого белка в процессе клеточного деления до сих пор окончательно не установлена. Однако одно его свойство делает Ki-67 незаменимым в онкологической диагностике: белок обнаруживается во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2, митоз) и полностью отсутствует в покоящихся клетках (G0). Проще говоря Ki-67 в ядре есть когда клетка делится, а если клетка «отдыхает» (фаза деления G0) – его нет. Это свойство превращает Ki-67 в своеобразный счётчик: подсчитав долю Ki-67-положительных клеток среди общего числа опухолевых клеток, можно получить объективную числовую величину – индекс пролиферации (обозначаемый также как Ki-67 labeling index, или Ki-67 LI). Эта величина отражает «фракцию роста» опухоли, то есть ту часть клеточной популяции, которая в данный момент находится в состоянии активного размножения.
Период полужизни белка Ki-67 после завершения митоза не превышает 60–90 минут: он быстро разрушается и не накапливается в клетках, вышедших из цикла деления. Это принципиально важное свойство означает, что Ki-67 отражает пролиферативный статус опухоли в текущий момент времени, а не суммарную историю предшествующих делений.

Пролиферативная активность является одной из ключевых характеристик опухолевого фенотипа. Она в значительной степени определяет, как быстро будет расти новообразование, насколько вероятно метастазирование и как опухоль ответит на терапию. Многие факторы, влияющие на течение и исход онкологического заболевания, реализуют своё действие через изменение именно этого параметра.
Высокий индекс Ki-67 указывает на то, что значительная часть опухолевых клеток активно делится. Такие опухоли, как правило, растут быстрее, склонны к более агрессивному течению и раннему метастазированию. Вместе с тем высокая пролиферативная активность нередко означает и большую чувствительность к химиотерапии, поскольку большинство цитостатических препаратов действуют именно на делящиеся клетки. Низкий индекс Ki-67 свидетельствует о медленном росте и, как правило, более благоприятном прогнозе, однако может указывать и на меньшую чувствительность к стандартной химиотерапии.

Это соотношение создаёт клинически значимый парадокс: наиболее агрессивные опухоли нередко лучше поддаются лекарственному лечению, тогда как медленнорастущие могут оказаться устойчивыми к нему. Индекс Ki-67 помогает врачу учесть этот фактор при планировании тактики.

Области клинического применения

Определение индекса Ki-67 выполняется на гистологическом материале и может быть проведено на двух видах биоматериала. Принцип исследования, используемые антитела (клон MIB-1) и критерии оценки результата идентичны вне зависимости от формы поступления ткани в лабораторию. Различаются этап, на котором материал передаётся для анализа, и клиническая задача исследования.

Первый вариант – ткань в формалиновом фиксаторе (формалиновый буфер). Биоптат или операционный материал поступает в лабораторию в 10% нейтральном забуференном формалине. Лаборатория выполняет полный цикл преаналитической подготовки: гистологическую проводку, заливку в парафин, микротомирование и иммуногистохимическое окрашивание. Этот вариант применяется, когда определение Ki-67 заказывается одновременно с первичным гистологическим исследованием и пролиферативный индекс необходим уже на этапе первичной диагностики. Типичные клинические ситуации: впервые верифицированный рак молочной железы (Ki-67 необходим для определения молекулярного подтипа и принятия решения о системной терапии), нейроэндокринные новообразования любой локализации (Ki-67 является обязательным элементом градации по классификации ВОЗ), лимфопролиферативные заболевания при необходимости разграничения индолентных и агрессивных форм, первичные опухоли центральной нервной системы при определении степени злокачественности глиом.

Второй вариант – готовый парафиновый блок. Ткань, ранее прошедшая фиксацию и заливку, хранится в архиве патоморфологического отделения. Из блока изготавливаются новые срезы для иммуногистохимического окрашивания. Этот вариант применяется ретроспективно, когда стандартное морфологическое исследование уже завершено, но для уточнения диагноза или коррекции лечебной тактики требуется дополнительная информация о пролиферативной активности опухоли. Показаниями являются: пересмотр диагноза и получение второго экспертного мнения, уточнение степени злокачественности при неоднозначных результатах первичной морфологической оценки, планирование или коррекция терапевтической тактики (в частности, при пограничных показаниях к адъювантной химиотерапии), а также сравнительная оценка пролиферативной активности первичной опухоли и рецидива с целью определения динамики биологического поведения новообразования.

Интерпретация результата

Результат исследования выражается как процент опухолевых клеток с положительно окрашенными ядрами. Принципиально важно, что единого порогового значения, одинаково применимого ко всем типам опухолей, не существует. Цифра, которая при одном заболевании свидетельствует о благоприятном прогнозе, при другом может указывать на крайне агрессивное течение. Клиническая интерпретация всегда определяется нозологической принадлежностью опухоли, её гистологическим вариантом и действующими классификационными системами. Ниже приведены наиболее значимые примеры.

Рак молочной железы. Индекс Ki-67 является одним из ключевых критериев суррогатного иммуногистохимического определения молекулярных подтипов опухоли, от которых непосредственно зависит стратегия лечения. Значения ниже 20% традиционно ассоциируются с люминальным А подтипом. Такие опухоли характеризуются более медленным ростом, благоприятным прогнозом и, как правило, достаточной эффективностью эндокринной (гормональной) терапии без необходимости добавления химиотерапии. Значения выше 20% указывают на люминальный В подтип, при котором биологическое поведение опухоли более агрессивно и в значительной части случаев требуется дополнение лечения цитотоксической химиотерапией.
На практике, однако, граница не столь однозначна. Диапазон 20–30% рассматривается многими экспертными группами как «серая зона», в которой один только Ki-67 не может служить основанием для окончательного терапевтического решения. В таких случаях международные рекомендации допускают привлечение дополнительных молекулярно-генетических тестов  для более точной оценки индивидуального риска рецидива и определения целесообразности химиотерапии. Эти тесты анализируют экспрессию панели генов в опухолевой ткани и позволяют выйти за пределы возможностей одного маркера.

Нейроэндокринные новообразования. В этой группе опухолей Ki-67 играет настолько определяющую роль, что без него градация по классификации ВОЗ невыполнима в принципе. Система разграничения построена на трёх уровнях. Опухоли с Ki-67 менее 3% относятся к Grade 1 (G1) – это высокодифференцированные новообразования с медленным ростом и наиболее благоприятным прогнозом. Значения от 3 до 20% соответствуют Grade 2 (G2) – промежуточной группе с вариабельным клиническим течением, при котором тактика определяется индивидуально. Ki-67 более 20% указывает на Grade 3 (G3) – низкодифференцированные нейроэндокринные карциномы, требующие незамедлительного начала агрессивных режимов системной терапии.
Клиническая дистанция между крайними градациями огромна. G1 нейроэндокринная опухоль может годами оставаться стабильной и контролироваться медикаментозно или хирургически. G3 нейроэндокринная карцинома – это принципиально иное заболевание с быстрым прогрессированием и качественно отличающимся прогнозом. Индекс Ki-67 в данном случае не просто дополняет диагноз, а фактически определяет его.

Лимфопролиферативные заболевания. Индекс пролиферации помогает разграничить индолентные (медленнотекущие) и агрессивные формы лимфом, что непосредственно определяет интенсивность терапевтического подхода. При фолликулярной лимфоме нарастание Ki-67 может служить одним из ранних признаков трансформации в диффузную В-крупноклеточную лимфому, что является значительно более агрессивным заболеванием, требующим интенсификации лечения. При диффузной В-крупноклеточной лимфоме пролиферативный индекс рассматривается как дополнительный прогностический фактор, высокие значения которого ассоциируются с менее благоприятным ответом на стандартные режимы иммунохимиотерапии.

Глиальные опухоли центральной нервной системы. Высокий индекс Ki-67 коррелирует с более высокой степенью злокачественности по классификации ВОЗ и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом. Этот параметр учитывается в комплексной оценке наряду с молекулярно-генетическими маркерами, значение которых в нейроонкологии неуклонно возрастает: мутации генов IDH1/IDH2, коделеция хромосомных плеч 1p/19q, статус метилирования промотора гена MGMT. Совокупность этих данных позволяет сформировать интегральную молекулярно-морфологическую характеристику опухоли и определить оптимальную лечебную тактику.

Саркомы мягких тканей. Ki-67 используется как дополнительный критерий оценки биологической агрессивности наряду со степенью гистологической дифференцировки, количеством митозов и наличием опухолевых некрозов. Высокие значения индекса ассоциируются с повышенным риском как местного рецидива, так и отдалённого метастазирования, что учитывается при определении объёма хирургического вмешательства и показаний к адъювантной терапии.

Во всех перечисленных нозологических группах действует общее правило: результат Ki-67 не интерпретируется изолированно. Он приобретает полноценный клинический смысл только в совокупности с морфологической характеристикой опухоли, данными расширенного иммуногистохимического профилирования, результатами молекулярно-генетических исследований, стадией заболевания и общим клиническим контекстом. Индекс пролиферации – это один из элементов диагностической мозаики, но элемент, без которого картина нередко остаётся неполной.

Ограничения метода

Индекс Ki-67 отражает пролиферативную активность опухоли, но не является самостоятельным диагностическим критерием. Он не позволяет определить, является ли образование доброкачественным или злокачественным, не устанавливает гистологический тип опухоли и не заменяет комплексное морфологическое исследование. Ki-67 – это прогностический и предиктивный параметр, который работает только в контексте полного патоморфологического заключения.

Результат зависит от качества материала. Неадекватная фиксация (слишком короткая или чрезмерно длительная экспозиция в формалине), повреждение ткани при заборе, артефакты проводки и заливки — всё это способно исказить картину окрашивания и привести к недостоверному результату. Парафиновые блоки длительного хранения также могут демонстрировать снижение интенсивности окрашивания вследствие деградации антигенов.

Ki-67 характеризует опухоль в конкретной точке времени и в конкретном участке ткани. Опухоли нередко неоднородны по пролиферативной активности: индекс может существенно различаться в центре и на периферии новообразования, в первичном очаге и метастазе, до и после лечения. Эта внутриопухолевая гетерогенность должна учитываться при интерпретации, и в ряде случаев патологу рекомендуется оценивать Ki-67 в наиболее активных участках опухоли (так называемых «горячих зонах»).