Иммуногистохимическое исследование p16INK4a: диагностика дисплазии и предрака шейки матки, формалиновый буфер

Рак шейки матки остаётся одним из наиболее распространённых онкологических заболеваний у женщин. Ведущим этиологическим фактором рака шейки матки является персистирующая инфекция вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска (ВПЧ ВР). ВПЧ обнаруживается в подавляющем большинстве случаев цервикального рака, и его роль в инициации канцерогенеза считается доказанной. Вместе с тем вирус является необходимым, но не достаточным условием злокачественной трансформации: абсолютное большинство женщин, инфицированных ВПЧ, никогда не заболевают раком шейки матки. Переход от инфекции к предраку и далее к инвазивной опухоли определяется взаимодействием вируса с рядом кофакторов, которые повышают вероятность персистенции инфекции и прогрессирования поражения.

К наиболее значимым кофакторам относятся

• Иммунодефицитные состояния, прежде всего ВИЧ-инфекция и ятрогенная иммуносупрессия (после трансплантации органов, на фоне аутоиммунной терапии), при которых способность организма к элиминации вируса существенно снижена.
• Курение является независимым фактором риска: канцерогены табачного дыма концентрируются в цервикальной слизи, оказывая прямое повреждающее действие на эпителий и подавляя местный иммунный ответ.
• Сопутствующие инфекции, передаваемые половым путём (хламидиоз, генитальный герпес), поддерживают хроническое воспаление в зоне трансформации и создают среду, благоприятствующую вирусной персистенции.
• Длительное применение комбинированных оральных контрацептивов (более 5 лет) ассоциируется с умеренным повышением риска, предположительно через гормональное влияние на экспрессию вирусных генов.
• Высокий паритет (многочисленные роды), раннее начало половой жизни и большое количество половых партнёров повышают вероятность как первичного инфицирования, так и реинфекции.
• Генетическая предрасположенность, связанная с особенностями системы HLA, определяет индивидуальную вариабельность иммунного ответа на ВПЧ.

Прогноз и возможности лечения напрямую зависят от стадии на момент диагностики. Когда опухоль обнаружена на прединвазивной или микроинвазивной стадии, удаление поражённого участка в значительной части случаев приводит к полному излечению и, что не менее важно, сохраняет репродуктивную функцию. Органосохраняющее лечение рака шейки матки является одним из активно развивающихся направлений современной онкогинекологии, и его успех целиком определяется качеством ранней диагностики предраковых состояний.
Центральное место в этой диагностике занимает оценка биологического потенциала диспластических изменений эпителия шейки матки. Далеко не каждая дисплазия прогрессирует в рак: лёгкие поражения в значительной части случаев регрессируют самостоятельно, тогда как умеренные и тяжёлые формы несут реальный риск злокачественной трансформации. Иммуногистохимическое определение экспрессии белка p16INK4a позволяет объективно оценить этот риск и разграничить поражения, требующие активного лечения, и те, за которыми допустимо наблюдение.

Патогенез ВПЧ-инфекции и механизм трансформации

Путь от здорового эпителия шейки матки до инвазивного рака представляет собой многолетний и бессимптомный процесс, движущей силой которого является персистирующая инфекция вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска (ВПЧ ВР). Однако однократное выявление вируса ещё не означает предрак. Подавляющее большинство случаев инфекции являются скоротечными и существенно не влияют на механизмы роста эпителиальных клеток: организм способен справиться с ВПЧ в течение 6–12 месяцев.
Решающим событием на пути к злокачественной трансформации является утрата контроля над двумя вирусными белками – Е6 и Е7.
В каждой клетке работают два независимых защитных механизма, своего рода два «тормоза».

• Первый – белок р53, который отвечает за остановку деления повреждённой клетки и запуск её гибели (апоптоза): если клетка накопила опасные мутации, р53 не позволит ей продолжить размножение.
• Второй – белок ретинобластомы (pRb), который контролирует переход клетки из фазы покоя в фазу активного деления: без его разрешения клетка не может начать делиться.

Вирусные белки Е6 и Е7 прицельно выводят из строя каждый из этих защитных узлов. Е6 связывается с р53 и направляет его на разрушение. Без р53 клетка с накопленными повреждениями ДНК продолжает делиться вместо того, чтобы погибнуть. Е7 связывается с pRb и блокирует его работу. Без pRb клетка вступает в деление непрерывно, без какого-либо внешнего стимула. По отдельности каждый из этих эффектов опасен. В сочетании они создают условия для неконтролируемого размножения клеток с нарастающей генетической нестабильностью, что со временем приводит к накоплению мутаций.

В норме вирус сам сдерживает продукцию Е6 и Е7 с помощью собственного регуляторного белка Е2. Пока Е2 работает, уровень Е6 и Е7 остаётся низким и безопасным для клетки. Когда этот внутренний контроль нарушается продукция Е6 и Е7 становится нерегулируемой, и запускается описанный выше каскад событий, ведущий к опухолевому перерождению.

Биологический смысл маркера

P16INK4a – белок, кодируемый геном CDKN2A, его физиологическая роль заключается в регуляции клеточного цикла: p16 участвует в опосредованном через белок ретинобластомы (pRb) контроле перехода клетки из стадии подготовки к делению в стадию активного удвоения ДНК. Пока pRb функционирует нормально, p16 способен подавлять опухолевый рост, запуская остановку клеточного цикла.
Роль этого белка в опухолях шейки матки принципиально отличается от его роли в большинстве других новообразований. При многих видах рака ген CDKN2A инактивируется, что приводит к нарушению регуляции клеточного цикла и бесконтрольному размножению клеток. В опухолях же, связанных с трансформирующим действием вируса папилломы человека, происходит обратное: экспрессия p16 резко возрастает. Вирусный белок Е7 функционально инактивирует pRb – ту самую "точку приложения", через которую p16 реализует своё тормозящее действие. Клетка распознаёт утрату контроля на уровне pRb и компенсаторно наращивает продукцию p16, однако этот аварийный ответ уже не способен остановить деление, поскольку мишень, на которую направлено торможение, разрушена.

Чтобы понять, насколько опасны изменения в шейке матки, используют специальный краситель, который выявляет белок p16. Важно знать, что повышенное количество (гиперэкспрессия) p16 не является прямым доказательством того, что вирус встроился в ДНК клетки. Это сигнал о том, что один из главных клеточных «тормозов» (белок pRb) сломан. А ломает его вирусный белок Е7, причём независимо от того, встроился вирус в геном или нет. 
Частота обнаружения гиперэкспрессии p16 закономерно нарастает по мере увеличения степени тяжести поражения. При тяжёлой дисплазии (CIN III) и инвазивном раке шейки матки повышенный p16 выявляется практически всегда, что указывает на устойчивое и необратимое нарушение контроля клеточного деления. При лёгкой дисплазии (CIN I / LSIL), напротив, гиперэкспрессия p16 обнаруживается значительно реже: на этой стадии клетки, как правило, ещё сохраняют функциональный контроль, и риск прогрессирования в рак остаётся минимальным.
Наиболее показательна ситуация с умеренной дисплазией (CIN II). Эта диагностическая категория биологически неоднородна. Часть поражений, морфологически классифицируемых как CIN II, по своей молекулярной природе уже является истинным предраком: контроль клеточного цикла в них устойчиво нарушен, и p16 будет повышен. Другая часть, при внешне сходной морфологической картине, биологически ближе к лёгкой дисплазии: механизмы контроля сохранны, p16 остаётся низким, и поражение с высокой вероятностью регрессирует самостоятельно. Именно эта гетерогенность CIN II делает определение p16 особенно клинически ценным: маркер позволяет разделить внешне похожие поражения на две принципиально разные по прогнозу группы и помогает врачу принять обоснованное решение – перейти к активному лечению или избрать наблюдательную тактику.

Интерпретация результата

Результат иммуногистохимического окрашивания на p16INK4a оценивается по стандартизированным критериям, ключевым из которых является понятие block-позитивности. Этот термин описывает строго определённый паттерн окрашивания, который отличает истинное предраковое поражение от неспецифических изменений.

Block-позитивный результат означает, что в эпителии обнаружена зона сильного, непрерывного окрашивания, захватывающего одновременно ядра и цитоплазму клеток и распространяющегося не менее чем на треть толщины эпителиального пласта. Принципиально важен именно непрерывный, блоковый характер реакции: окрашенные клетки образуют сплошной массив, а не разрозненные очаги. В соответствии с системой LAST такой результат при морфологически неоднозначном поражении является основанием для классификации его как HSIL (поражение высокой степени). Для пациентки это означает необходимость активной тактики: расширенного обследования и, при подтверждении диагноза HSIL, рассмотрения вопроса об эксцизионном лечении – удалении поражённого участка шейки матки.

Отсутствие block-позитивности – это полное отсутствие окрашивания, либо слабая, прерывистая или очаговая реакция, что свидетельствует о том, что устойчивого нарушения контроля клеточного цикла в данном участке эпителия нет. Очаговое окрашивание, даже если отдельные клетки реагируют интенсивно, не соответствует критериям block-позитивности и не должно расцениваться как положительный результат. Такое поражение классифицируется как LSIL (поражение низкой степени), даже если морфологическая картина формально допускала более высокую градацию. Для пациентки это, как правило, означает возможность наблюдательной тактики с контрольным обследованием через рекомендованный интервал, без немедленного хирургического вмешательства.

Результат окрашивания на p16 никогда не оценивается сам по себе, в отрыве от остальных данных. Он приобретает полноценный клинический смысл только при сопоставлении с морфологической картиной в стандартно окрашенных препаратах, результатами цитологии, ВПЧ-тестирования и кольпоскопии. Определение p16 делает гистологическую оценку более объективной и воспроизводимой, но не подменяет комплексное клинико-морфологическое заключение.

Отличие от двойного окрашивания p16/Ki-67

В лабораторном каталоге может присутствовать другое исследование – двойное иммуногистохимическое окрашивание p16INK4a + Ki-67 (dual stain). Два теста различаются по материалу, контексту и диагностической задаче.

Двойное окрашивание p16/Ki-67 рекомендовано в первую очередь как метод триажа ВПЧ-положительных пациенток. Исследование выполняется преимущественно на цитологическом материале (жидкостная цитология) и решает вопрос: направлять ли пациентку на кольпоскопию и биопсию? Критерием положительности является обнаружение хотя бы одной клетки с коэкспрессией обоих маркеров в одном ядре. Двойное окрашивание не заменяет гистологическую диагностику и не предназначен для определения степени дисплазии в тканевом материале.
Моноокрашивание на p16 выполняется на гистологическом материале (биоптат, конус) и решает принципиально иную задачу: верификацию степени поражения в уже полученной ткани в соответствии с рекомендациями LAST. Здесь критерием является block-позитивность, а не коэкспрессия двух маркеров.

Маркеры частично пересекаются, но клинические контексты, материал, критерии интерпретации и диагностические задачи различны.

Ограничения метода

Иммуногистохимическое определение p16INK4a имеет ряд ограничений.

P16 не является самостоятельным диагностическим критерием злокачественности. Он не позволяет установить гистологический тип опухоли, не определяет стадию заболевания и не заменяет комплексное морфологическое исследование. Экспрессия p16 представляет собой вспомогательный параметр, клиническое значение которого реализуется исключительно в контексте полного патоморфологического заключения и в соответствии с критериями системы LAST.
Гиперэкспрессия p16 не является абсолютно специфичной для ВПЧ-ассоциированных поражений. Диффузное окрашивание, формально соответствующее критериям block-позитивности, может наблюдаться при тубарной метаплазии эндоцервикса – доброкачественном состоянии, не связанном с вирусной инфекцией. В таких случаях дифференциальная диагностика требует расширения иммуногистохимической панели (Ki-67, p53, ER, PR) и тщательного сопоставления с морфологией.
Возрастные особенности экспрессии должны учитываться при интерпретации. У молодых пациенток возможна транзиторная экспрессия p16, ассоциированная с активной, но ещё не завершившейся ВПЧ-инфекцией, которая в дальнейшем может спонтанно разрешиться. Это не означает ложноположительность маркера, но требует осторожности в клинической трактовке.
Фокальная экспрессия p16 может наблюдаться в регенерирующем эпителии после ранее проведённого лечения (эксцизия, абляция). Информация о предшествующих вмешательствах на шейке матки должна быть доступна патоморфологу для корректной интерпретации.