Иммуногистохимия (ИГХ) p16INK4a: диагностика дисплазии и предрака шейки матки, парафиновый блок

Исследование представляет собой иммуногистохимическое определение белка p16INK4a в ткани шейки матки, полученной при биопсии. В отличие от цитологических анализов, где изучают отдельные клетки в мазке, здесь исследуют срез ткани с сохранённой структурой эпителия — это позволяет оценить не только сами клетки, но и то, как изменения распределены по слоям эпителиального пласта. Материалом служит готовый парафиновый блок с фрагментом биоптата, поэтому повторное вмешательство для исследования не требуется. 
Белок p16 в норме участвует в торможении деления клеток. При длительной инфекции вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска его выработка резко возрастает, и это служит косвенным признаком того, что вирус запустил в клетках процесс перерождения. Окрашивание ткани на p16 показывает, где именно и насколько распространённо накопился этот белок, что помогает врачу-патологу отличить истинные предраковые изменения от внешне похожих на них доброкачественных состояний. 
Анализ назначают, когда обычного исследования биоптата под микроскопом недостаточно для уверенного заключения: при спорной степени дисплазии, при необходимости отличить предрак от реактивных или возрастных изменений эпителия, при подтверждении связи поражения с вирусом папилломы человека. Это уточняющее исследование, которое проводится по решению врача на уже взятом материале и помогает поставить точный диагноз.

Клиническое значение

Диагностическая ценность p16 в ткани шейки матки основана на характере его накопления. При истинном предраковом поражении, связанном с трансформирующей инфекцией вируса папилломы человека, белок p16 накапливается интенсивно и непрерывно, охватывая базальный и парабазальный слои эпителия на протяжённом участке. Такое распределение называют блоковым окрашиванием, и именно оно служит признаком поражения высокой степени. Очаговое, прерывистое или слабое окрашивание отдельных клеток не имеет того же значения и трактуется как отрицательный результат, поскольку встречается и при доброкачественных процессах. Различие между блоковым и очаговым характером окрашивания составляет основу интерпретации этого исследования.

Биологический смысл маркёра связан с тем, как вирус нарушает защитные механизмы клетки. В здоровой клетке работают два независимых тормоза опухолевого роста. Первый из них, белок p53, останавливает деление повреждённой клетки и при необходимости запускает её гибель, не позволяя клетке с накопленными мутациями размножаться. Второй, белок ретинобластомы (pRb), контролирует переход клетки из состояния покоя к активному делению. Вирусные онкобелки E6 и E7 прицельно выводят из строя оба тормоза: E6 направляет p53 на разрушение, после чего клетка с повреждениями ДНК продолжает делиться вместо гибели, а E7 блокирует pRb, и клетка начинает делиться непрерывно, без внешнего стимула. В сочетании эти эффекты создают условия для неконтролируемого размножения клеток с нарастающей генетической нестабильностью. В норме сам вирус сдерживает выработку E6 и E7 с помощью собственного регуляторного белка E2; когда этот внутренний контроль нарушается, продукция E6 и E7 становится нерегулируемой и запускается каскад, ведущий к перерождению клеток.

Белок p16INK4a, кодируемый геном CDKN2A, в норме участвует в торможении клеточного цикла через тот же ретинобластомный путь: пока pRb функционирует, p16 способен останавливать деление. Роль p16 в опухолях шейки матки отличается от его роли при большинстве других новообразований. При многих видах рака ген CDKN2A инактивируется, и уровень белка падает. В опухолях, связанных с вирусом папилломы человека, происходит обратное: выработка p16 резко возрастает. Это объясняется тем, что вирусный онкобелок E7 выводит из строя pRb — точку приложения, через которую p16 реализует своё тормозящее действие. Клетка распознаёт утрату контроля и компенсаторно наращивает выработку p16, однако этот аварийный ответ уже неэффективен, поскольку мишень торможения разрушена. Важно, что повышение p16 не является доказательством встраивания вируса в ДНК клетки: это сигнал о том, что работа pRb нарушена вирусным белком E7, независимо от того, интегрировался вирус в геном или нет.

Частота накопления p16 закономерно нарастает со степенью тяжести поражения. При тяжёлой дисплазии (CIN III) и инвазивном раке повышенный p16 выявляется практически всегда, что указывает на устойчивое и необратимое нарушение контроля клеточного деления. При лёгкой дисплазии (CIN I, соответствующей LSIL) блоковое накопление p16 встречается значительно реже, поскольку на этой стадии клетки обычно сохраняют функциональный контроль, а риск прогрессирования невысок. Наиболее показательна умеренная дисплазия (CIN II): эта категория биологически неоднородна. Часть поражений, морфологически классифицируемых как CIN II, по молекулярной природе уже является истинным предраком с устойчиво нарушенным контролем клеточного цикла, и p16 в них накапливается по блоковому типу. Другая часть при внешне сходной картине биологически ближе к лёгкой дисплазии, контроль деления в ней сохранён, p16 остаётся низким, и поражение с высокой вероятностью регрессирует. Именно эта гетерогенность CIN II делает определение p16 особенно ценным: маркёр разделяет внешне похожие поражения на две принципиально разные по прогнозу группы.

Главная клиническая ниша исследования — разрешение сомнительных гистологических случаев. Морфологическая оценка биоптата по обычной окраске бывает субъективной, и наибольшие трудности возникают при умеренной дисплазии (CIN II), которую разные специалисты могут трактовать по-разному, а также при разграничении истинной дисплазии и доброкачественных состояний со схожей микроскопической картиной: незрелой плоскоклеточной метаплазии, атрофии, реактивных и репаративных изменений. В этих ситуациях блоковое окрашивание p16 подтверждает поражение высокой степени (HSIL, соответствующее CIN II–III), а его отсутствие склоняет заключение в сторону доброкачественного процесса или поражения низкой степени. Применение p16 в таких случаях повышает воспроизводимость диагноза между разными патологами.

Результат оценивается по стандартизированным критериям, ключевым из которых является блоковая позитивность. Блоково-позитивным считается сильное непрерывное окрашивание, захватывающее одновременно ядро и цитоплазму клеток и распространяющееся от базального слоя вверх не менее чем на треть толщины эпителиального пласта; принципиально важно, что окрашенные клетки образуют сплошной массив, а не разрозненные очаги. Отсутствием блоковой позитивности считают полное отсутствие реакции либо слабое, прерывистое или очаговое окрашивание; даже когда отдельные клетки реагируют интенсивно, такая картина не соответствует критериям и не расценивается как положительный результат. Согласно международным рекомендациям по терминологии плоскоклеточных поражений нижних отделов половых путей (LAST, разработаны Коллегией американских патологов и Американским обществом кольпоскопии), блоковая позитивность при морфологически неоднозначном поражении служит основанием классифицировать его как HSIL, а её отсутствие соответствует поражению низкой степени, даже если морфология формально допускала более высокую градацию.

Иммуногистохимия p16 показана в строго определённых ситуациях: при морфологическом сомнении между предраком и доброкачественным состоянием, при дифференциальной диагностике умеренной дисплазии и при необходимости уточнить степень поражения. При морфологически очевидных результатах, таких как явная норма или несомненная дисплазия низкой степени, окрашивание p16 не требуется и может ввести в заблуждение, поскольку повышение p16 встречается и в части доброкачественных изменений. По этой же причине p16 не используется как единственный критерий: положительное окрашивание не приравнивается автоматически к предраку, а оценивается вместе с морфологической картиной, результатами цитологии, ВПЧ-тестирования и кольпоскопии.

Это исследование следует отличать от двойного окрашивания p16 и Ki-67, которое может присутствовать в каталоге отдельно. Двойное окрашивание выполняется преимущественно на цитологическом материале и применяется как метод триажа ВПЧ-позитивных пациенток, решая вопрос о направлении на кольпоскопию; критерием положительного результата там служит совместное появление обоих маркёров в одной клетке. Моноокрашивание на p16, описываемое здесь, выполняется на гистологическом материале (биоптате или конусе) и решает иную задачу: верификацию степени поражения в уже полученной ткани по критерию блоковой позитивности в соответствии с рекомендациями LAST. Материал, контекст применения и критерии интерпретации у этих исследований различаются.

Исследование имеет ограничения, которые учитываются при интерпретации. Положительное блоковое окрашивание подтверждает связь поражения с вирусом папилломы человека и его высокую степень, но окончательный диагноз и степень всегда устанавливаются на основании совокупной морфологической и иммуногистохимической оценки, а не одного маркёра; p16 не определяет гистологический тип опухоли, не устанавливает стадию и не заменяет полное патоморфологическое заключение. Само по себе накопление p16 не определяет тактику лечения — решение принимает лечащий врач по результатам полного заключения, клинических данных и сопутствующих исследований. Блоковое окрашивание не абсолютно специфично для ВПЧ-ассоциированных поражений: оно встречается и при тубарной метаплазии эндоцервикса, доброкачественном состоянии, не связанном с вирусом, поэтому в спорных случаях иммуногистохимическую панель расширяют дополнительными маркёрами (Ki-67, p53, рецепторы эстрогенов и прогестерона) и тщательно сопоставляют с морфологией. У молодых пациенток возможна транзиторная экспрессия p16 при активной, но ещё не завершившейся вирусной инфекции, которая в дальнейшем может разрешиться самостоятельно, что требует осторожности в трактовке. Фокальное накопление p16 встречается в регенерирующем эпителии после ранее проведённого лечения (эксцизия, абляция), поэтому сведения о предшествующих вмешательствах на шейке матки должны быть доступны патологу. Часть поражений может развиваться по механизмам без характерного накопления p16, поэтому отрицательный результат не исключает патологию полностью и оценивается в контексте всей доступной информации.

Что влияет на результат анализа

Достоверность результата определяется прежде всего качеством исходного биопсийного материала и его обработки. Объём и ориентация фрагмента ткани в парафиновом блоке должны позволять оценить полную толщину эпителия с базальным слоем, иначе характер окрашивания может быть оценён неверно. Условия фиксации биоптата, длительность пребывания материала в формалине, корректность проводки и приготовления срезов влияют на сохранность антигена и интенсивность реакции. Несоблюдение протокола иммуногистохимического окрашивания, качество антител и контроль реакции напрямую сказываются на воспроизводимости результата. Выраженное воспаление, механическое повреждение ткани при заборе, термические артефакты от электрохирургических методов взятия биопсии затрудняют интерпретацию. Результат всегда оценивается в привязке к морфологической картине того же биоптата: изолированная оценка окрашивания без сопоставления с гистологической структурой не допускается. Корректная интерпретация требует участия врача-патолога, владеющего критериями блокового и очагового окрашивания.