ПЦР-диагностика коклюша (Bordetella pertussis) и бронхосептикоза (Bordetella bronchiseptica) в мазке

Анализ выявляет ДНК двух видов рода Bordetella — Bordetella pertussis и Bordetella bronchiseptica — в соскобе слизистой ротоглотки или носоглотки методом ПЦР. Результат выдаётся раздельно по каждому возбудителю в формате обнаружено / не обнаружено. Исследование направлено на дифференциальную идентификацию указанных видов — в отличие от тестов, дающих родовой ответ, без разграничения отдельных представителей Bordetella. Референсным биоматериалом для молекулярной диагностики возбудителей рода Bordetella служит назофарингеальный материал — соскоб со слизистой носоглотки гибким тонким тампоном с синтетическим наконечником; соскоб со слизистой ротоглотки допускается как альтернативный биоматериал, однако обладает существенно меньшей клинической чувствительностью. Это связано с биологическими особенностями возбудителей: B. pertussis имеет строгую тропность именно к цилиндрическому эпителию носоглотки, и выявление её в ротоглотке затруднено в силу низкой концентрации. Хлопковые тампоны для молекулярной диагностики не применяются — они ингибируют ПЦР.

B. pertussis — специфический патоген человека, классический возбудитель коклюша. Заболевание остаётся клинически значимой инфекцией, несмотря на массовую вакцинацию: снижение защитного иммунитета с возрастом определяет активную циркуляцию возбудителя в популяции, где особому риску подвергаются невакцинированные младенцы. Типичная клиническая картина развивается поэтапно — от малосимптомной катаральной фазы к характерной пароксизмальной, с приступами спазматического кашля, репризами, рвотой после кашлевого приступа, и далее к длительной реконвалесценции. У привитых подростков и взрослых клиника нередко атипична, проявляется затяжным сухим кашлем без выраженных пароксизмов. Коклюш подлежит обязательной регистрации и санитарно-эпидемиологическому надзору.

B. bronchiseptica — первичный возбудитель респираторных инфекций у животных (собак, кошек, свиней, кроликов). У человека клинически значимая инфекция встречается редко и преимущественно в узких группах пациентов: у лиц с тесным профессиональным или бытовым контактом с животными (ветеринары, работники питомников, владельцы больных животных), у иммунокомпрометированных пациентов (с ВИЧ-инфекцией, после трансплантации, на интенсивной иммуносупрессии), у пациентов с муковисцидозом. Клинические формы у человека разнообразны — от бессимптомного носительства до трахеобронхита, пневмонии, редко системных инфекций у тяжело иммунокомпрометированных пациентов. В общей клинической практике у иммунокомпетентных взрослых и детей B. bronchiseptica — редкая этиологическая находка.

Клиническая значимость дифференциальной идентификации двух видов определяется прежде всего разницей их клинического профиля и терапевтических последствий. При положительном результате на B. pertussis диагностика и ведение строятся по алгоритму коклюшной инфекции — с учётом стадии заболевания, возрастной группы пациента, эпидемиологической ситуации; антибактериальная терапия препаратами группы макролидов максимально эффективна в ранние сроки. При положительном результате на B. bronchiseptica клинический подход индивидуализирован: учитывается иммунный статус пациента, эпидемиологические факторы (контакт с животными), локализация и характер инфекции; антибактериальная терапия выбирается с учётом известного профиля чувствительности возбудителя, при необходимости с опорой на культуральное исследование. 
Диагностические характеристики ПЦР имеют важную временную специфику, принципиальную для корректной интерпретации результата и раскрывающуюся в полной мере только при исследовании назофарингеального материала. Чувствительность метода максимальна в раннюю фазу коклюшной инфекции — в катаральной и ранней пароксизмальной стадии, обычно в первые две-три недели от начала кашля, когда возбудитель активно размножается и присутствует в носоглотке в высокой концентрации. По мере прогрессирования заболевания количество возбудителя в носоглотке снижается, и после четвёртой недели от начала кашля чувствительность ПЦР существенно падает; у пациентов, обследованных в поздние сроки заболевания, отрицательный результат ПЦР не исключает коклюша, и приоритет этиологической диагностики смещается на серологическое исследование — определение специфических антител к коклюшному токсину (IgG анти-PT).

Лабораторная диагностика коклюша исторически включала культуральное исследование с посевом на селективные среды; метод высокоспецифичен, но имеет невысокую чувствительность и требует длительного инкубирования. Молекулярные методы обеспечивают значительно более высокую чувствительность и быстрый ответ и стали основным инструментом ранней этиологической диагностики. Для эпидемиологического расследования с типированием штаммов и для оценки чувствительности к антибактериальным препаратам культуральное исследование сохраняет необходимое место.

ПЦР выявляет специфические участки генома B. pertussis (обычно инсерционная последовательность IS481 или участки гена коклюшного токсина) и B. bronchiseptica, обеспечивая раздельную видовую идентификацию. Метод не зависит от жизнеспособности возбудителя и сохраняет чувствительность при ранней антибактериальной терапии, хотя и она снижает концентрацию возбудителя в пробе.

Клиническое значение

Основной клинический сценарий применения исследования — этиологическая верификация у пациентов с клинической картиной, подозрительной на коклюш, с одновременным дифференциальным определением возможного инфицирования B. bronchiseptica. Дифференциальный характер теста имеет особое значение у пациентов, для которых клинически важно разграничение между классической коклюшной инфекцией и инфекцией, вызванной B. bronchiseptica: у иммунокомпрометированных пациентов с респираторной симптоматикой, у пациентов с муковисцидозом при дифференциальной диагностике возбудителей хронических инфекций дыхательных путей, у лиц с профессиональным контактом с животными, у пациентов с атипичной клинической картиной, не укладывающейся в типичный коклюш.

У пациентов с типичной клинической картиной коклюша, без факторов риска инфицирования B. bronchiseptica (контакта с животными, иммуносупрессии), дифференциальный характер теста клинически менее значим: в подавляющем большинстве случаев этиологическим агентом служит именно B. pertussis, и родового ответа было бы достаточно. Дифференциальный тест рационально применять там, где видовая идентификация имеет самостоятельное клиническое или эпидемиологическое значение.

Отдельное клинически значимое применение — обследование младенцев с респираторной симптоматикой, особенно с апноэ или атипичной клинической картиной, в контексте возможного заражения от кого-либо из членов семьи с длительным кашлем. Раннее этиологическое подтверждение инфекции критически важно: заболевание в этой возрастной группе потенциально тяжёлое, требует госпитализации и специфической терапии, а выявленный случай запускает санитарно-эпидемиологические мероприятия в семейном окружении.

Третий сценарий — обследование в очагах коклюша. Работа с очагом регулируется действующими санитарно-эпидемиологическими правилами и клиническими рекомендациями, включая рекомендации Роспотребнадзора по профилактике коклюшной инфекции.

Положительный результат на B. pertussis у пациента с соответствующей клинической картиной подтверждает коклюш и служит основанием для назначения этиотропной антибактериальной терапии препаратами группы макролидов, особенно эффективной в ранние сроки. Помимо влияния на индивидуальную клинику, своевременная терапия ограничивает эпидемиологическую опасность пациента для контактных лиц. Запускаются санитарно-эпидемиологические мероприятия — регистрация случая, обследование контактных лиц, при необходимости профилактическое лечение близких младенческого возраста. 
Положительный результат на B. bronchiseptica у пациента с клинической картиной и эпидемиологическими факторами (контакт с животными, иммуносупрессия) служит этиологическим подтверждением редкой инфекции. Клинический подход индивидуализируется в зависимости от иммунного статуса пациента, характера инфекции (трахеобронхит, пневмония, другие формы), при необходимости проводится культуральное исследование с оценкой чувствительности возбудителя к антибактериальным препаратам. 
Одновременный положительный результат на оба возбудителя — крайне редкая клиническая ситуация, требующая тщательной клинической оценки, включая исключение возможной контаминации и анализ индивидуальных эпидемиологических факторов.

Отрицательный результат по обоим возбудителям снижает вероятность их участия в клинической картине, но должен интерпретироваться с учётом сроков обследования и типа биоматериала. У пациента, обследованного поздно — после четвёртой недели от начала кашля, — отрицательный результат ПЦР не исключает коклюш, и при клиническом подозрении диагностика дополняется серологическим исследованием. При отрицательном результате, полученном на соскобе со слизистой ротоглотки у пациента с высоким клиническим подозрением на коклюш, обследование должно быть дополнено исследованием назофарингеального материала, обеспечивающего максимальную чувствительность. У пациента с длительным кашлем и отрицательным результатом диагностический поиск смещается на другие возможные причины — инфекции Mycoplasma pneumoniae и Chlamydia pneumoniae, вирусные инфекции, неинфекционные причины длительного кашля (бронхиальная астма, гастроэзофагеальный рефлюкс, постинфекционный кашель).

Ограничения

Метод ПЦР выявляет ДНК возбудителя и не говорит о его жизнеспособности. Тест обеспечивает дифференциальное видовое определение двух представителей рода Bordetella — B. pertussis и B. bronchiseptica; другие виды этого рода, в том числе B. parapertussis (возбудитель паракоклюша, клинически сходного с коклюшем, но обычно более лёгкого заболевания, не предотвращаемого коклюшной вакциной), данным исследованием не детектируются. При клинической картине коклюшеподобного синдрома и отрицательных результатах по B. pertussis и B. bronchiseptica остаётся вероятность паракоклюша; при клинической необходимости его верификации выполняется отдельное исследование. Клиническая чувствительность исследования критически зависит от типа биоматериала: назофарингеальный соскоб служит референсным биоматериалом и обеспечивает максимальную чувствительность метода; соскоб со слизистой ротоглотки существенно уступает по чувствительности и применяется как альтернативный биоматериал в ситуациях, когда получение назофарингеального материала невозможно. Чувствительность метода имеет выраженную зависимость от сроков заболевания: максимальна в первые две-три недели от начала кашля, значительно снижается после четвёртой недели; у пациентов, обследованных в поздние сроки, отрицательный результат не исключает коклюш, и при клиническом подозрении диагностика дополняется серологическим исследованием. Другие возбудители коклюшеподобного синдрома — M. pneumoniae, C. pneumoniae, респираторные вирусы — данным исследованием не детектируются и при клинической необходимости их этиологической диагностики выполняются отдельные исследования. На чувствительность метода влияет предшествующая системная антибактериальная терапия, прежде всего препаратами группы макролидов, снижающая количество возбудителя в пробе. Качество забора материала имеет существенное значение: применяются гибкие тонкие тампоны с синтетическим наконечником (дакрон, нейлон), хлопковые тампоны для молекулярной диагностики не используются из-за ингибирующего влияния на реакцию. Культуральное исследование, необходимое для определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам и для эпидемиологического расследования с типированием штаммов, ПЦР не заменяет. Результат исследования требует интерпретации врачом — инфекционистом, педиатром, терапевтом, пульмонологом — с учётом клинической картины, сроков заболевания, эпидемиологического анамнеза, вакцинального статуса пациента, результатов серологического обследования при его выполнении и общей клинической ситуации.