Дифференциальная диагностика меланомы, иммуногистохимическое (ИГХ) исследование, оценка экспрессии S-100, Melan A (MART-1), HMB-45, SOX-10, формалиновый буфер

Иммуногистохимия (ИГХ) – метод морфологической диагностики, основанный на выявлении специфических белков (антигенов) в клетках и тканях с помощью меченых антител. Принцип метода заключается в том, что антитела избирательно связываются с искомым белком, а визуализирующая система позволяет увидеть эту реакцию под микроскопом в виде окрашивания определённого цвета, чаще коричневого. Интенсивность и локализация окраски указывают на наличие и распределение исследуемого белка в опухолевых клетках.

Меланома – злокачественная опухоль, происходящая из меланоцитов, клеток, вырабатывающих пигмент меланин. Частота меланом составляет 1,8–2,2 на 100 тысяч населения и около 1% от всех злокачественных новообразований. Заболевание несколько чаще возникает у женщин, чем у мужчин. Преимущественная локализация различается в зависимости от пола и возраста: у женщин меланома чаще развивается на нижних конечностях (голень), у мужчин – на туловище (преимущественно спина), у лиц старшей возрастной группы – на коже лица. Примерно в 70% случаев меланома развивается на месте врождённых или приобретённых невусов, и лишь в 28–30%  на неизменённой коже (melanoma cutis de novo).

В типичных случаях диагностика меланомы не вызывает затруднений: опухоль содержит пигмент, имеет характерное гистологическое строение, и диагноз устанавливается при стандартном морфологическом исследовании. Однако меланома отличается выраженной гетерогенностью и способностью имитировать другие новообразования.

Беспигментные (амеланотические) меланомы полностью лишены пигмента и при обычной микроскопии могут быть неотличимы от недифференцированных карцином или сарком. Веретеноклеточные варианты напоминают фибросаркому или лейомиосаркому. Мелкоклеточные формы требуют дифференциальной диагностики с лимфомами и мелкоклеточным раком. Встречается редкий вариант – десмопластическая меланома, с выраженным фиброзным компонентом, может быть ошибочно принята за рубец или доброкачественное фиброзное образование. Эпителиоидноклеточные формы имитируют карциномы.

Выявление специфических меланоцитарных маркеров позволяет установить гистогенез опухоли и верифицировать диагноз меланомы.

Панель иммуногистохимических маркеров меланомы

Диагностика меланомы основана на использовании панели маркеров, поскольку ни один из них не обладает абсолютной чувствительностью и специфичностью. Комбинированный подход позволяет минимизировать риск диагностических ошибок.

S-100
Протеин S-100 был впервые идентифицирован в 1965 году B.W. Moore и получил своё название благодаря растворимости в 100% насыщенном растворе сульфата аммония. Относится к семейству кальций-связывающих белков с молекулярной массой 21 кДа, участвующих в регуляции клеточного цикла, дифференцировки и взаимодействия цитоскелета с мембраной. Локализуется в клеточной мембране, цитоплазме и ядре.
В диагностике меланомы S-100 используется как высокочувствительный скрининговый маркер. Чувствительность превышает 95%, что делает его практически универсальным маркером меланомы. Положительная реакция наблюдается во всех гистологических вариантах, включая десмопластическую и веретеноклеточную формы, где другие маркеры часто негативны.

Основное ограничение S-100 – низкая специфичность. Белок экспрессируется в широком спектре нормальных тканей и опухолей: шванновских клетках и опухолях периферических нервов (шванномы, нейрофибромы), клетках Лангерганса и гистиоцитах с антиген-презентирующей функцией, фолликулярных дендритных клетках, хондроцитах и хрящевых опухолях, адипоцитах и липосаркомах, миоэпителиальных клетках, клетках мозгового вещества надпочечников.

Диагностическое значение: отрицательная реакция на S-100 делает диагноз меланомы крайне маловероятным. Однако положительный результат требует подтверждения более специфичными маркерами.

SOX-10
SOX-10 (member of the sex-determining region Y-related HMG-box family) – транскрипционный фактор, кодируемый геном на 22-й хромосоме (локус 22q13.1). Участвует в регуляции миграции клеток нервного гребня на этапах эмбриогенеза и в дифференцировке клеток меланоцитарной линии. В современной практике рассматривается как один из наиболее ценных маркеров для диагностики меланомы.
SOX-10 сочетает высокую чувствительность (более 95%) с более высокой по сравнению с S-100 специфичностью. Ядерная локализация окрашивания облегчает интерпретацию, особенно при скудном клеточном материале. Маркер сохраняет экспрессию в десмопластических и веретеноклеточных меланомах, чувствительность и специфичность SOX-10 для десмопластической меланомы достигает 98%, тогда как HMB-45 и Melan-A выявляются в этом варианте лишь примерно в 10% случаев.

Ограничения: SOX-10 экспрессируется в клетках с признаками глиальной и шванновской дифференцировки, миоэпителиальных клетках слюнных, бронхиальных, эккриновых и молочных желёз, а также в тучных клетках различных тканей (как в ядре, так и в цитоплазме). Кроме того, маркер положителен в светлоклеточной саркоме мягких тканей – редкой опухоли, гистогенетически связанной с меланомой и представляющей наибольшие трудности при дифференциальной диагностике.

HMB-45
HMB-45 (Human Melanoma Black-45) – антитело, распознающее гликопротеин gp100 (также обозначаемый как Melanosome Specific Antigen, MSA) с молекулярной массой около 10 кДа. Белок локализуется на внутренней мембране премеланосом 1, 2, 3-го типов (органелл меланоцитов), в которых происходит синтез и накопление меланина.
HMB-45 является высокоспецифичным маркером меланоцитарной дифференцировки. Однако его чувствительность ниже, чем у Melan-A, и составляет около 75–85% для типичных меланом. В десмопластических и веретеноклеточных вариантах маркер выявляется лишь примерно в 10% случаев.

Ограничения: помимо меланоцитарных опухолей, HMB-45 может быть положительным в ПЭКомах (периваскулярных эпителиоидноклеточных опухолях), ангиомиолипомах почки, лимфангиолейомиоматозе, светлоклеточной «сахарной» опухоли лёгкого. Эти опухоли относятся к семейству PEC-ом и характеризуются аберрантной меланоцитарной дифференцировкой.
Особенность экспрессии в невусах: в доброкачественных невусах HMB-45 обычно положителен только в поверхностных отделах (зона созревания), тогда как в меланоме окрашивание диффузное. Этот признак может использоваться при дифференциальной диагностике.

Melan-A (MART-1)
Melan-A (Melanoma Antigen Recognized by T-cells 1, MART-1) – белок с молекулярной массой 20–22 кДа, связанный с эндоплазматическим ретикулумом и локализованный на внутренней мембране премеланосом 1, 2, 3-го типов. Является мишенью для цитотоксических T-лимфоцитов, что используется в иммунотерапии меланомы.
Melan-A более чувствителен, чем HMB-45, с чувствительностью около 80–90% для типичных меланом. Однако, как и HMB-45, он часто отрицателен в десмопластических и веретеноклеточных вариантах (выявляется лишь примерно в 10% случаев).

Ограничения: Melan-A экспрессируется в стероидпродуцирующих клетках коры надпочечников, яичников и яичек, а также в соответствующих опухолях (адренокортикальные опухоли, опухоли из клеток Лейдига и Сертоли, некоторые опухоли яичников). Это важно учитывать при дифференциальной диагностике метастазов неизвестного первичного очага.

В ряде случаев может проводиться определение экспрессии дополнительных маркеров:

MITF
MITF (Microphthalmia-associated Transcription Factor) – транскрипционный фактор, являющийся ведущим регуляторным меланоцитарным ядерным белком. Регулирует экспрессию ключевых белков меланогенеза: тирозиназы, тирозиназа-связанного белка TYRP1, а также MART-1 и GP-100. Чувствительность составляет 81–100% в зависимости от исследования. Как и SOX-10, даёт ядерное окрашивание, что облегчает интерпретацию. Однако экспрессия часто отрицательна в десмопластических и веретеноклеточных вариантах. Специфичность умеренная, MITF экспрессируется также в макрофагах, остеокластах, тучных клетках и соответствующих опухолях.

PNL2
PNL2 (Melanoma Associated Antigen) – белок, присутствующий в цитоплазме активированных меланоцитов и меланоцитарных опухолей. Несоответствие в названиях объясняется тем, что PNL2 – это «имя» антитела (клон), а Melanoma Associated Antigen – это описание того, что оно выявляет.
Относительно новый маркер, демонстрирующий высокую чувствительность. Антитела к PNL2 обладают высокой чувствительностью для выявления метастатической меланомы – до 87%, что превышает показатели HMB-45 (около 76%) и MART-1 (около 82%) в данном контексте.

Особенность: PNL2 выявляет внутриэпидермальные невусы, в то время как дермальный компонент сложных невусов не реагирует с антителами к PNL2. Эта характеристика может быть использована при дифференциальной диагностике.

Диагностический алгоритм

Рациональный подход к ИГХ-диагностике меланомы предполагает поэтапное применение маркеров.

На первом этапе используются высокочувствительные маркеры S-100 и/или SOX-10. Отрицательная реакция на оба маркера практически исключает меланому и требует поиска альтернативного диагноза. Положительная реакция подтверждает принадлежность опухоли к нейроэктодермальной линии дифференцировки и требует уточнения.

На втором этапе применяются высокоспецифичные маркеры HMB-45 и Melan-A. Положительная реакция хотя бы на один из них подтверждает меланоцитарную природу опухоли. Отрицательная реакция на оба маркера при позитивном S-100/SOX-10 требует дифференциальной диагностики с опухолями нервных оболочек и тщательного анализа гистологической картины.

При подозрении на десмопластическую или веретеноклеточную меланому опора делается на S-100 и SOX-10, поскольку HMB-45 и Melan-A в этих вариантах выявляются лишь примерно в 10% случаев.

Интерпретация результатов

Заключение иммуногистохимического исследования включает детальное описание экспрессии каждого маркера, входящего в диагностическую панель, с обязательным указанием характера, интенсивности и распределения окрашивания, а также его внутриклеточной локализации. Эти параметры имеют принципиальное значение, поскольку диагностическая ценность маркера определяется не только фактом его экспрессии, но и морфологическим паттерном окрашивания в ткани.

Характер экспрессии . Положительная иммуногистохимическая реакция может носить диффузный или очаговый характер, что отражает степень вовлечения опухолевой популяции. Диффузная экспрессия (более 75% опухолевых клеток) типична для большинства меланом и повышает диагностическую уверенность. Очаговая экспрессия (менее 25% клеток) требует более осторожной интерпретации и расширения панели маркеров.

Интенсивность окрашивания квалифицируется как выраженная, умеренная или слабая. Оценка проводится с учётом используемой методики, качества контрольных образцов и особенностей тканевой фиксации. Слабая интенсивность может отражать как биологические особенности опухоли (низкая экспрессия антигена), так и технические факторы (субоптимальная фиксация, истощение антигенности при длительном хранении блоков).

Внутриклеточная локализация должна соответствовать известным характеристикам маркера. S-100 даёт мембранно-цитоплазматическое и ядерное окрашивание. SOX-10, MITF и PRAME — ядерные маркеры; цитоплазматическое окрашивание без ядерного компонента расценивается как неспецифическое. HMB-45 и Melan-A демонстрируют цитоплазматическую реакцию. Несоответствие локализации ожидаемой может указывать на артефакт или перекрёстную реактивность.

Количественная оценка . Для ядерных маркеров (SOX-10, MITF, PRAME) и пролиферативного индекса Ki-67 указывается доля позитивных клеток в процентах. Индекс Ki-67 в меланомах обычно превышает 5–10%, тогда как в доброкачественных невусах, как правило, составляет менее 5%. Высокий пролиферативный индекс (более 20–25%) ассоциирован с агрессивным течением. Для PRAME диффузная ядерная экспрессия в более чем 50–75% клеток поддерживает диагноз меланомы.

Комплексный подход к интерпретации . Результаты иммуногистохимии оцениваются патологоанатомом исключительно в контексте гистологической картины, архитектоники опухоли, цитологических особенностей клеток и клинических данных. Изолированная трактовка одного маркера без учёта остальных компонентов панели и морфологии ткани считается методологически некорректной и может приводить к диагностическим ошибкам.

Типичный иммунофенотип меланомы включает позитивную реакцию на S-100 и SOX-10 (высокочувствительные маркеры), а также на HMB-45 и Melan-A (высокоспецифичные маркеры меланоцитарной дифференцировки). Отсутствие экспрессии цитокератинов и лейкоцитарного антигена CD45 позволяет исключить карциномы и лимфопролиферативные заболевания.

Отклонения от классического иммунофенотипа возможны и должны учитываться при интерпретации. Десмопластическая и веретеноклеточная меланомы часто демонстрируют утрату экспрессии HMB-45 и Melan-A при сохранении позитивности по S-100 и SOX-10. Метастатические меланомы могут показывать более вариабельный профиль, чем первичные опухоли. В отдельных случаях наблюдается очаговая или слабая экспрессия маркеров, что требует расширения панели и тщательной корреляции с клинико-морфологическими данными.

Особенности интерпретации при метастазах . При исследовании метастатических очагов без известного первичного очага положительная экспрессия меланоцитарных маркеров позволяет установить меланому как источник метастазирования. Следует учитывать, что метастазы могут демонстрировать частичную утрату маркеров по сравнению с первичной опухолью. Рекомендуется использование расширенной панели, включающей не менее двух высокочувствительных (S-100, SOX-10) и двух высокоспецифичных (HMB-45, Melan-A) маркеров.

Типичные диагностические сложности:

• Беспигментная меланома с эпителиоидной морфологией может имитировать карциному; решающее значение имеет негативность по цитокератинам при позитивности меланоцитарных маркеров
• Веретеноклеточная меланома при негативных HMB-45 и Melan-A требует дифференциальной диагностики с саркомами и опухолями нервных оболочек; опора делается на SOX-10 в сочетании с клинико-морфологическими данными
• Слабая или очаговая экспрессия маркеров не исключает меланому и требует расширения панели
• Экспрессия S-100 и SOX-10 в опухолях нервных оболочек (MPNST, шванномы) не позволяет использовать эти маркеры изолированно; необходимо подтверждение HMB-45 или Melan-A

Ключевым принципом интерпретации является комплексный подход. Результаты иммуногистохимии оцениваются патологоанатомом исключительно в контексте гистологической картины, архитектоники опухоли, цитологических особенностей клеток и клинических данных.

Важно! Согласно требованиям п. 17 Правил проведения патолого-анатомических исследований, утв. Приказом Минздрава России от 24.03.2016 № 179н, в целях уточнения диагноза заболевания (состояния) с учетом требований стандартов  медицинской помощи и клинических рекомендаций (протоколов лечения) по вопросам оказания медицинской помощи на этапе микроскопии биопсийного (операционного) материала врачом-патологоанатомом дополнительно может быть назначено проведение:

• дополнительных методов окраски микропрепаратов (постановки реакции, определения) - гистохимических, иммуногистохимических, электронно-микроскопических, молекулярно-биологических, генетических и иных методов;
• дополнительных методов микроскопии - поляризационной, флуоресцентной, трансмиссионной или сканирующей электронной и иных методов.

Применение вышеуказанных методов исследования, назначенных врачом-патологоанатомом при проведении исследования в целях уточнения диагноза заболевания (состояния), подлежит дополнительной оплате.