Цитологическое исследование шейки матки (жидкостная цитология) с определением p16/Ki-67

Исследование маркеров p16INK4a и Ki-67 может выполняться на трёх видах материала: жидкостном цитологическом препарате (мазке), ткани в формалиновом фиксаторе (до заливки в парафин) и готовом парафиновом блоке. Биологический принцип, маркеры и критерии интерпретации во всех случаях идентичны. Различаются этап, на котором материал поступает в лабораторию, и клиническая задача исследования.

Рак шейки матки остаётся одним из наиболее распространённых онкологических заболеваний у женщин и сохраняет статус серьёзной медицинской и социальной проблемы даже в экономически развитых странах. Ежегодная частота первичного выявления составляет 10–12 случаев на 100 000 женщин. Прогноз и возможности лечения напрямую зависят от стадии на момент диагностики. Когда опухоль обнаружена на прединвазивной или микроинвазивной стадии, удаление поражённого участка в значительной части случаев приводит к полному излечению и, что не менее важно, сохраняет репродуктивную функцию. Органосохраняющее лечение рака шейки матки является одним из активно развивающихся направлений современной онкогинекологии, и его успех целиком определяется качеством ранней диагностики.
Путь от здорового эпителия шейки матки до инвазивного рака занимает много лет и имеет бессимптомное течение, движущей силой процесса является персистирующая инфекция вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска (ВПЧ ВР). Однако однократное выявление вируса ещё не означает предрак. Подавляющее большинство случаев инфекции являются скоротечными и существенно не влияют на механизмы роста эпителиальных клеток: организм способен элиминировать (выводить) ВПЧ в течение 6–12 месяцев. Переход от инфекции к предраку и далее к инвазивной опухоли определяется взаимодействием вируса с рядом кофакторов, которые повышают вероятность персистенции инфекции и прогрессирования поражения.

К наиболее значимым кофакторам относятся

• Иммунодефицитные состояния, прежде всего ВИЧ-инфекция и ятрогенная иммуносупрессия (после трансплантации органов, на фоне аутоиммунной терапии), при которых способность организма к элиминации вируса существенно снижена.
• Курение является независимым фактором риска: канцерогены табачного дыма концентрируются в цервикальной слизи, оказывая прямое повреждающее действие на эпителий и подавляя местный иммунный ответ.
• Сопутствующие инфекции, передаваемые половым путём (хламидиоз, генитальный герпес), поддерживают хроническое воспаление в зоне трансформации и создают среду, благоприятствующую вирусной персистенции.
• Длительное применение комбинированных оральных контрацептивов (более 5 лет) ассоциируется с умеренным повышением риска, предположительно через гормональное влияние на экспрессию вирусных генов.
• Высокий паритет (многочисленные роды), раннее начало половой жизни и большое количество половых партнёров повышают вероятность как первичного инфицирования, так и реинфекции.
• Генетическая предрасположенность, связанная с особенностями системы HLA, определяет индивидуальную вариабельность иммунного ответа на ВПЧ.

Клинически значимой ситуация становится тогда, когда вирусная ДНК интегрируется в геном эпителиальной клетки. После интеграции в ядрах начинается репликация вирусных онкопротеинов (белков с онкогенным потенциалом) Е6 и Е7, которые подавляют ключевые механизмы клеточного контроля и запускают неопластическую трансформацию (злокачественное перерождение). Этот переломный момент перехода от транзиторного носительства к трансформирующей инфекции  и фиксирует двойное иммуногистохимическое окрашивание на p16INK4a и Ki-67.

Биологический смысл маркеров

P16INK4a – это белок, который кодируется геном CDKN2A, его физиологическая роль заключается в торможении деления и размножения клеток. Он работает через так называемый ретинобластомный путь: белок ретинобластомы (pRb) контролирует переход клетки из фазы покоя в фазу активного деления, и пока этот механизм исправен, потребности в высоком уровне p16 нет. Роль этого белка в опухолях шейки матки принципиально отличается от его роли в большинстве других новообразований. При многих видах рака ген CDKN2A, кодирующий белок p16 выключается, в результате клетка теряет один из тормозов деления и начинает бесконтрольно делиться. В опухолях же, вызванных вирусом папилломы человека, происходит обратное: уровень p16 резко возрастает. Механизм этого парадокса хорошо изучен. Вирусный белок Е7 выводит из строя pRb ("тормозной механизм", на который воздействует белок p16), клетка распознаёт утрату контроля и компенсаторно наращивает продукцию p16. Однако этот аварийный ответ уже не способен остановить деление, поскольку точка приложения тормоза – сам pRb – разрушена. В итоге высокий уровень p16 становится не защитным механизмом, а косвенным признаком того, что вирусная ДНК встроилась в геном клетки и запустила процесс опухолевого перерождения.

Ki-67 – ядерный белок, который состоит из двух полипептидных цепей (345 и 395 кДа) и связан с 10-й хромосомой. Ki-67 входит в структуру клеточного ядра в период между делениями и ассоциируется с хромосомами во время митоза (деления). Ki-67 имеет практическую ценность, так как он всегда обнаруживается во всех активных фазах клеточного размножения (G1, S, G2, митоз) и полностью отсутствует в покоящихся клетках (G0). Это делает его надёжным индикатором того, что клетка находится в состоянии активного деления.

Доля делящихся клеток в опухоли, обозначаемая как «фракция роста», является одной из ключевых характеристик злокачественного новообразования. От неё в значительной степени зависят скорость роста опухоли, её способность к метастазированию, ответ на лечение и исход заболевания. Определение индекса пролиферации по экспрессии Ki-67 сегодня считается обязательным исследованием при любой онкопатологии.

По отдельности каждый из двух маркеров имеет ограничения. Повышение p16 изредка наблюдается при воспалительных и реактивных процессах. Ki-67 возрастает при любом усиленном делении клеток, будь то воспаление или регенерация. Решающее значение приобретает их одновременное присутствие в одной и той же клетке. В здоровом эпителии такое сочетание практически невозможно: активно делящаяся клетка не нуждается в максимальном уровне p16, а клетка с высоким p16 в норме прекращает деление. Когда оба маркера обнаруживаются в одном ядре одновременно, это высокоспецифичный признак того, что нормальная регуляция клеточного цикла сломана и клетка находится под контролем вирусных белков. Для положительного заключения достаточно выявления хотя бы одной такой двойноположительной клетки.

Области клинического применения

Двойное окрашивание p16/Ki-67 используется в двух различных клинических ситуациях, и важно чётко их разграничивать.

Первый и основной сценарий – цитологический триаж. Исследование выполняется на мазке (жидкостном цитологическом препарате) у женщин, чьи результаты скрининга оказались неопределёнными или пограничными. Врач стоит перед конкретным вопросом: направить пациентку на кольпоскопию или можно безопасно продолжить наблюдение? Двойное окрашивание помогает принять это решение на основе объективного биологического критерия, а не только морфологической оценки, которая неизбежно содержит элемент субъективности. Это наиболее массовое и клинически востребованное применение теста.

Второй сценарий – уточнение диагноза по ткани. Здесь исследование выполняется на парафиновом блоке из фрагмента ткани, полученном при биопсии или конизации шейки матки, зафиксированном и залитом в парафин. Задача принципиально иная: помочь патологу объективно разграничить изменения, которые при стандартном окрашивании могут выглядеть очень похоже. Реактивное воспаление, начальная дисплазия (CIN I) и клинически значимая дисплазия (CIN II+) нередко создают морфологическую картину, допускающую неоднозначную трактовку. Рутинная гистология, основанная на оценке строения эпителия и признаков воздействия ВПЧ, не застрахована от диагностических расхождений между специалистами. Это не недостаток метода, а объективная реальность: два опытных патолога, глядя на один и тот же срез, могут прийти к разным заключениям. Двойное окрашивание p16/Ki-67 вносит в эту оценку объективный молекулярный критерий и существенно повышает воспроизводимость диагноза. Особую ценность тест приобретает при разграничении дисплазии умеренной и тяжёлой степени (CIN II–III) и начальных форм рака, включая аденокарциному in situ и микроинвазивную аденокарциному, где цена диагностической ошибки наиболее высока.

Интерпретация результата

Положительный результатом считается обнаружение хотя бы одной клетки, в ядре которой одновременно присутствуют оба маркера, что свидетельствует о наличии в эпителии шейки матки клетки с нарушенной регуляцией деления. Это означает, что вирус папилломы человека не просто присутствует в ткани, а уже активно вмешивается в работу клеточного цикла, и риск прогрессирования в сторону клинически значимой дисплазии или рака реален. Количественные данные подтверждают эту связь: при умеренной дисплазии (CIN II) усиленная экспрессия p16INK4a выявляется в 80–100% случаев, при тяжёлой дисплазии (CIN III) и инвазивном раке – практически всегда.
Для врача положительный результат является основанием для активной тактики. В первую очередь это расширенная кольпоскопия с прицельной биопсией из наиболее подозрительных участков. Если гистологическое исследование биоптата подтверждает CIN II или более тяжёлое поражение, рассматривается вопрос об эксцизионном лечении – удалении поражённого участка шейки матки. Важно подчеркнуть: само по себе положительное двойное окрашивание не является диагнозом. Оно указывает направление, но окончательное решение всегда принимается на основании гистологической верификации, то есть исследования ткани под микроскопом.

Отрицательным результатом является отсутствие клеток с коэкспрессией обоих маркеров, это существенно снижает вероятность того, что за неоднозначной цитологической картиной скрывается клинически значимое поражение. Для пациентки это означает возможность избежать кольпоскопии и связанных с ней инвазивных процедур на данном этапе. Для врача данный факт является обоснованием наблюдательной тактики с повторным обследованием через рекомендованный интервал. Это особенно важно в ситуациях, когда цитологическое заключение попадает в так называемую «серую зону» (ASC-US, LSIL): морфологическая картина в этих случаях часто допускает различные трактовки, и без дополнительного объективного критерия врач вынужден выбирать между риском пропустить предрак и риском подвергнуть пациентку ненужному вмешательству. Двойное окрашивание помогает выйти из этого диагностического тупика.
Следует, однако, помнить, что отрицательный результат не даёт абсолютной гарантии отсутствия поражения. Он означает, что вероятность клинически значимой патологии низкая, но не нулевая. Поэтому даже при отрицательном тесте пациентка остаётся под динамическим наблюдением в соответствии с действующими клиническими рекомендациями.

Диагностическая эффективность

Любой диагностический тест оценивается по двум ключевым параметрам: чувствительности и специфичности. Чувствительность показывает, какую долю реально больных тест способен выявить. Специфичность показывает какую долю здоровых он корректно определяет как здоровых. Идеальный тест должен обладать и тем, и другим на уровне, близком к 100%, но в реальной медицине между этими показателями почти всегда существует компромисс: повышение одного нередко ведёт к снижению другого.

Двойное окрашивание p16/Ki-67 демонстрирует редкое для скрининговых инструментов сочетание. Крупные многоцентровые валидационные исследования показали, что чувствительность теста в выявлении CIN II и более тяжёлых поражений составляет 85–92%. Это означает, что из 100 женщин с реальной клинически значимой дисплазией тест обнаружит от 85 до 92. Данный показатель сопоставим с чувствительностью ВПЧ-тестирования, которое на сегодняшний день считается наиболее чувствительным методом первичного скрининга.

Главное преимущество двойного окрашивания раскрывается в специфичности. ВПЧ-тест обладает высокой чувствительностью, но его специфичность ограничена: он выявляет присутствие вируса, но не способен отличить транзиторное носительство от трансформирующей инфекции. В результате значительная часть ВПЧ-положительных женщин направляется на кольпоскопию без реальной необходимости. Двойное окрашивание p16/Ki-67, фиксируя не просто наличие вируса, а факт нарушения клеточного цикла под его воздействием, существенно превышает ВПЧ-тест по специфичности.

Практическим следствием этого становится значительное сокращение числа ненужных кольпоскопий – по данным исследований, на 40–50%. При этом выявляемость истинного предрака остаётся столь же высокой. 

Ограничения метода

При всей диагностической ценности двойного окрашивания p16/Ki-67 этот метод, как и любой другой в медицине, имеет чётко очерченные границы применимости. Прежде всего, тест не является и не может являться методом первичного скрининга. Он не предназначен для массового обследования всех женщин и не заменяет ни цитологическое исследование (мазок на онкоцитологию), ни ВПЧ-тестирование. Его место в диагностическом алгоритме – между первичным скринингом и инвазивной диагностикой, в роли инструмента, уточняющего показания к кольпоскопии.
Двойное окрашивание не заменяет гистологическую верификацию. Окончательный диагноз CIN II, CIN III или инвазивного рака выставляется только по результатам морфологического исследования ткани, полученной при биопсии или конизации. Положительный результат двойного окрашивания указывает на высокий риск, но сам по себе диагнозом не является. Это принципиальное разграничение, которое должно быть ясно как врачу, так и пациентке.

Существуют и ограничения, связанные с биологией самих маркеров. Экспрессия p16 в редких случаях наблюдается при процессах, не связанных с ВПЧ: в тубарной метаплазии эндоцервикса, некоторых реактивных состояниях и отдельных ВПЧ-негативных аденокарциномах. Эти ситуации нечасты, но врач-патолог должен учитывать их при интерпретации.

Рак шейки матки остаётся одним из наиболее распространённых онкологических заболеваний у женщин и сохраняет статус серьёзной медицинской и социальной проблемы даже в экономически развитых странах. Ежегодная частота первичного выявления составляет 10–12 случаев на 100 000 женщин. Прогноз и возможности лечения напрямую зависят от стадии на момент диагностики. Когда опухоль обнаружена на прединвазивной или микроинвазивной стадии, удаление поражённого участка в значительной части случаев приводит к полному излечению и, что не менее важно, сохраняет репродуктивную функцию. Органосохраняющее лечение рака шейки матки является одним из активно развивающихся направлений современной онкогинекологии, и его успех целиком определяется качеством ранней диагностики.
Путь от здорового эпителия шейки матки до инвазивного рака занимает много лет и имеет бессимптомное течение, движущей силой процесса является персистирующая инфекция вирусом папилломы человека высокого онкогенного риска (ВПЧ ВР). Однако однократное выявление вируса ещё не означает предрак. Подавляющее большинство случаев инфекции являются скоротечными и существенно не влияют на механизмы роста эпителиальных клеток: организм способен элиминировать (выводить) ВПЧ в течение 6–12 месяцев. Клинически значимой ситуация становится тогда, когда вирусная ДНК интегрируется в геном эпителиальной клетки. После интеграции в ядрах начинается репликация вирусных онкопротеинов (белков с онкогенным потенциалом) Е6 и Е7, которые подавляют ключевые механизмы клеточного контроля и запускают неопластическую трансформацию (злокачественное перерождение). Этот переломный момент перехода от транзиторного носительства к трансформирующей инфекции  и фиксирует двойное иммуногистохимическое окрашивание на p16INK4a и Ki-67.

Биологический смысл маркеров

P16INK4a – это белок, который кодируется геном CDKN2A, его физиологическая роль заключается в торможении деления и размножения клеток. Он работает через так называемый ретинобластомный путь: белок ретинобластомы (pRb) контролирует переход клетки из фазы покоя в фазу активного деления, и пока этот механизм исправен, потребности в высоком уровне p16 нет. Роль этого белка в опухолях шейки матки принципиально отличается от его роли в большинстве других новообразований. При многих видах рака ген CDKN2A, кодирующий белок p16 выключается, в результате клетка теряет один из тормозов деления и начинает бесконтрольно делиться. В опухолях же, вызванных вирусом папилломы человека, происходит обратное: уровень p16 резко возрастает. Механизм этого парадокса хорошо изучен. Вирусный белок Е7 выводит из строя pRb ("тормозной механизм", на который воздействует белок p16), клетка распознаёт утрату контроля и компенсаторно наращивает продукцию p16. Однако этот аварийный ответ уже не способен остановить деление, поскольку точка приложения тормоза – сам pRb – разрушена. В итоге высокий уровень p16 становится не защитным механизмом, а косвенным признаком того, что вирусная ДНК встроилась в геном клетки и запустила процесс опухолевого перерождения.

Ki-67 – ядерный белок, который состоит из двух полипептидных цепей (345 и 395 кДа) и связан с 10-й хромосомой. Ki-67 входит в структуру клеточного ядра в период между делениями и ассоциируется с хромосомами во время митоза (деления). Ki-67 имеет практическую ценность, так как он всегда обнаруживается во всех активных фазах клеточного размножения (G1, S, G2, митоз) и полностью отсутствует в покоящихся клетках (G0). Это делает его надёжным индикатором того, что клетка находится в состоянии активного деления.

Доля делящихся клеток в опухоли, обозначаемая как «фракция роста», является одной из ключевых характеристик злокачественного новообразования. От неё в значительной степени зависят скорость роста опухоли, её способность к метастазированию, ответ на лечение и исход заболевания. Определение индекса пролиферации по экспрессии Ki-67 сегодня считается обязательным исследованием при любой онкопатологии.

По отдельности каждый из двух маркеров имеет ограничения. Повышение p16 изредка наблюдается при воспалительных и реактивных процессах. Ki-67 возрастает при любом усиленном делении клеток, будь то воспаление или регенерация. Решающее значение приобретает их одновременное присутствие в одной и той же клетке. В здоровом эпителии такое сочетание практически невозможно: активно делящаяся клетка не нуждается в максимальном уровне p16, а клетка с высоким p16 в норме прекращает деление. Когда оба маркера обнаруживаются в одном ядре одновременно, это высокоспецифичный признак того, что нормальная регуляция клеточного цикла сломана и клетка находится под контролем вирусных белков. Для положительного заключения достаточно выявления хотя бы одной такой двойноположительной клетки.

Области клинического применения

Двойное окрашивание p16/Ki-67 используется в двух различных клинических ситуациях, и важно чётко их разграничивать.

Первый и основной сценарий – цитологический триаж. Исследование выполняется на мазке (жидкостном цитологическом препарате) у женщин, чьи результаты скрининга оказались неопределёнными или пограничными. Врач стоит перед конкретным вопросом: направить пациентку на кольпоскопию или можно безопасно продолжить наблюдение? Двойное окрашивание помогает принять это решение на основе объективного биологического критерия, а не только морфологической оценки, которая неизбежно содержит элемент субъективности. Это наиболее массовое и клинически востребованное применение теста.

Второй сценарий – уточнение диагноза по ткани. Здесь исследование выполняется на парафиновом блоке из фрагмента ткани, полученном при биопсии или конизации шейки матки, зафиксированном и залитом в парафин. Задача принципиально иная: помочь патологу объективно разграничить изменения, которые при стандартном окрашивании могут выглядеть очень похоже. Реактивное воспаление, начальная дисплазия (CIN I) и клинически значимая дисплазия (CIN II+) нередко создают морфологическую картину, допускающую неоднозначную трактовку. Рутинная гистология, основанная на оценке строения эпителия и признаков воздействия ВПЧ, не застрахована от диагностических расхождений между специалистами. Это не недостаток метода, а объективная реальность: два опытных патолога, глядя на один и тот же срез, могут прийти к разным заключениям. Двойное окрашивание p16/Ki-67 вносит в эту оценку объективный молекулярный критерий и существенно повышает воспроизводимость диагноза. Особую ценность тест приобретает при разграничении дисплазии умеренной и тяжёлой степени (CIN II–III) и начальных форм рака, включая аденокарциному in situ и микроинвазивную аденокарциному, где цена диагностической ошибки наиболее высока.

Интерпретация результата

Положительный результатом считается обнаружение хотя бы одной клетки, в ядре которой одновременно присутствуют оба маркера, что свидетельствует о наличии в эпителии шейки матки клетки с нарушенной регуляцией деления. Это означает, что вирус папилломы человека не просто присутствует в ткани, а уже активно вмешивается в работу клеточного цикла, и риск прогрессирования в сторону клинически значимой дисплазии или рака реален. Количественные данные подтверждают эту связь: при умеренной дисплазии (CIN II) усиленная экспрессия p16INK4a выявляется в 80–100% случаев, при тяжёлой дисплазии (CIN III) и инвазивном раке – практически всегда.
Для врача положительный результат является основанием для активной тактики. В первую очередь это расширенная кольпоскопия с прицельной биопсией из наиболее подозрительных участков. Если гистологическое исследование биоптата подтверждает CIN II или более тяжёлое поражение, рассматривается вопрос об эксцизионном лечении – удалении поражённого участка шейки матки. Важно подчеркнуть: само по себе положительное двойное окрашивание не является диагнозом. Оно указывает направление, но окончательное решение всегда принимается на основании гистологической верификации, то есть исследования ткани под микроскопом.

Отрицательным результатом является отсутствие клеток с коэкспрессией обоих маркеров, это существенно снижает вероятность того, что за неоднозначной цитологической картиной скрывается клинически значимое поражение. Для пациентки это означает возможность избежать кольпоскопии и связанных с ней инвазивных процедур на данном этапе. Для врача данный факт является обоснованием наблюдательной тактики с повторным обследованием через рекомендованный интервал. Это особенно важно в ситуациях, когда цитологическое заключение попадает в так называемую «серую зону» (ASC-US, LSIL): морфологическая картина в этих случаях часто допускает различные трактовки, и без дополнительного объективного критерия врач вынужден выбирать между риском пропустить предрак и риском подвергнуть пациентку ненужному вмешательству. Двойное окрашивание помогает выйти из этого диагностического тупика.
Следует, однако, помнить, что отрицательный результат не даёт абсолютной гарантии отсутствия поражения. Он означает, что вероятность клинически значимой патологии низкая, но не нулевая. Поэтому даже при отрицательном тесте пациентка остаётся под динамическим наблюдением в соответствии с действующими клиническими рекомендациями.

Диагностическая эффективность

Любой диагностический тест оценивается по двум ключевым параметрам: чувствительности и специфичности. Чувствительность показывает, какую долю реально больных тест способен выявить. Специфичность показывает какую долю здоровых он корректно определяет как здоровых. Идеальный тест должен обладать и тем, и другим на уровне, близком к 100%, но в реальной медицине между этими показателями почти всегда существует компромисс: повышение одного нередко ведёт к снижению другого.

Двойное окрашивание p16/Ki-67 демонстрирует редкое для скрининговых инструментов сочетание. Крупные многоцентровые валидационные исследования показали, что чувствительность теста в выявлении CIN II и более тяжёлых поражений составляет 85–92%. Это означает, что из 100 женщин с реальной клинически значимой дисплазией тест обнаружит от 85 до 92. Данный показатель сопоставим с чувствительностью ВПЧ-тестирования, которое на сегодняшний день считается наиболее чувствительным методом первичного скрининга.

Главное преимущество двойного окрашивания раскрывается в специфичности. ВПЧ-тест обладает высокой чувствительностью, но его специфичность ограничена: он выявляет присутствие вируса, но не способен отличить транзиторное носительство от трансформирующей инфекции. В результате значительная часть ВПЧ-положительных женщин направляется на кольпоскопию без реальной необходимости. Двойное окрашивание p16/Ki-67, фиксируя не просто наличие вируса, а факт нарушения клеточного цикла под его воздействием, существенно превышает ВПЧ-тест по специфичности.

Практическим следствием этого становится значительное сокращение числа ненужных кольпоскопий – по данным исследований, на 40–50%. При этом выявляемость истинного предрака остаётся столь же высокой. 

Ограничения метода

При всей диагностической ценности двойного окрашивания p16/Ki-67 этот метод, как и любой другой в медицине, имеет чётко очерченные границы применимости. Прежде всего, тест не является и не может являться методом первичного скрининга. Он не предназначен для массового обследования всех женщин и не заменяет ни цитологическое исследование (мазок на онкоцитологию), ни ВПЧ-тестирование. Его место в диагностическом алгоритме – между первичным скринингом и инвазивной диагностикой, в роли инструмента, уточняющего показания к кольпоскопии.
Двойное окрашивание не заменяет гистологическую верификацию. Окончательный диагноз CIN II, CIN III или инвазивного рака выставляется только по результатам морфологического исследования ткани, полученной при биопсии или конизации. Положительный результат двойного окрашивания указывает на высокий риск, но сам по себе диагнозом не является. Это принципиальное разграничение, которое должно быть ясно как врачу, так и пациентке.

Существуют и ограничения, связанные с биологией самих маркеров. Экспрессия p16 в редких случаях наблюдается при процессах, не связанных с ВПЧ: в тубарной метаплазии эндоцервикса, некоторых реактивных состояниях и отдельных ВПЧ-негативных аденокарциномах. Эти ситуации нечасты, но врач-патолог должен учитывать их при интерпретации.