Анализ химерного гена BCR/ABL - t(9;22), определение типа транскрипта BCR/ABL гена методом ПЦР

Анализ выявляет в крови или костном мозге следы патологического гена, который образуется при особой хромосомной перестройке и служит молекулярной причиной развития нескольких видов лейкозов. У здорового человека участки двух разных хромосом, 9-й и 22-й, занимают свои постоянные места. При определённой мутации части этих хромосом меняются местами, и на образовавшейся новой хромосоме, получившей название филадельфийской, два гена случайно соединяются в один — патологический гибридный ген BCR-ABL1. Этот ген кодирует фермент, который постоянно работает с избыточной активностью и заставляет клетки крови делиться без должного контроля. Так развивается хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) и одна из тяжёлых форм острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), которую называют Ph-позитивной (с филадельфийской хромосомой). Сама мутация происходит уже в зрелом возрасте в клетках крови, она не наследуется и не передаётся детям. В отличие от многих опухолевых маркёров, гибридный ген BCR-ABL1 является не просто признаком заболевания, а его непосредственной причиной, поэтому его обнаружение служит основанием для постановки диагноза. Анализ проводится методом ПЦР, который позволяет уловить даже небольшое количество патологических клеток и одновременно установить тип образовавшегося гибридного гена. От типа гибридного гена зависит выбор количественного теста, по которому в будущем отслеживают ответ на лечение.

Клиническое значение

Точка разрыва в гене BCR может располагаться в разных его участках, поэтому из транслокации t(9;22) формируются химерные транскрипты разного строения, которым соответствуют гибридные белки разной молекулярной массы. Основной тип, обозначаемый как p210, определяется более чем у 95% пациентов с хроническим миелоидным лейкозом и реже у части пациентов с Ph-позитивным острым лимфобластным лейкозом. В рамках данного теста p210 представлен двумя наиболее частыми вариантами слияния экзонов — b2a2 (e13a2) и b3a2 (e14a2). Транскрипт p190 кодирует более короткий гибридный белок и характерен для Ph-позитивного острого лимфобластного лейкоза, особенно у детей, где встречается примерно в 90% случаев; при ХМЛ p190 наблюдается значительно реже и часто ассоциирован с более агрессивным течением. p190 определяется в данном тесте по вариантам слияния e1a2 и e1a3. Помимо этих основных форм существуют редкие нетипичные варианты химерного транскрипта, в том числе p230 и другие, ассоциированные с особыми клиническими формами Ph-позитивных заболеваний; они выходят за пределы стандартной молекулярной панели и при клиническом подозрении выявляются отдельными расширенными исследованиями. Знание определённого в тесте типа транскрипта помогает не только подтвердить диагноз, но и сузить круг возможных вариантов заболевания: преимущественное обнаружение p190 у взрослого пациента склоняет к диагнозу Ph-позитивного ОЛЛ, тогда как p210 указывает в первую очередь на ХМЛ.

При подозрении на ХМЛ положительный качественный результат с обнаружением p210 (или реже p190) подтверждает диагноз. Клинически ХМЛ проявляется лейкоцитозом со сдвигом лейкоцитарной формулы влево до миелоцитов и промиелоцитов, увеличением селезёнки, иногда увеличением печени; в анализе крови наблюдается базофилия и эозинофилия. Само по себе обнаружение BCR-ABL1 при таких изменениях устанавливает диагноз ХМЛ независимо от выраженности симптомов, поскольку транслокация t(9;22) присутствует только при этом заболевании и нескольких родственных Ph-позитивных состояниях. При подозрении на острый лимфобластный лейкоз обнаружение BCR-ABL1, особенно транскрипта p190, выделяет Ph-позитивный вариант ОЛЛ — клинически наиболее тяжёлую форму, требующую особой тактики лечения с включением ингибиторов тирозинкиназы наряду со стандартной химиотерапией.

Определение типа транскрипта в момент первичной диагностики имеет ключевое значение для последующего наблюдения за пациентом. Лечение Ph-позитивных лейкозов основано на применении ингибиторов тирозинкиназы, которые блокируют патологическую активность гибридного фермента BCR-ABL и в большинстве случаев позволяют добиться длительной молекулярной ремиссии. Эффективность лечения отслеживается по динамике количества химерной РНК в крови, и для каждого типа транскрипта используется отдельный количественный тест: при p210 применяется мониторинг по международной шкале (International Scale, IS) с оценкой глубины молекулярного ответа (MR), при p190 используется отдельный количественный тест по соотношению с контрольным геном. Поэтому без определения типа транскрипта в дебюте заболевания корректное проведение последующего мониторинга невозможно. Качественный тип-определяющий анализ закладывает основу для всей последующей молекулярной диагностики у конкретного пациента.

Отрицательный результат при клинических подозрениях на ХМЛ или Ph-позитивный ОЛЛ имеет диагностическую ценность и сам по себе. Отсутствие химерного транскрипта BCR-ABL1 исключает наиболее частые формы Ph-позитивных лейкозов как причину лейкоцитоза и сдвига формулы влево; диагностический поиск переключается на другие миелопролиферативные новообразования (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз с мутациями JAK2, CALR, MPL) или на реактивные лейкоцитозы. У пациента с ОЛЛ отрицательный BCR-ABL1 исключает Ph-позитивный вариант и ориентирует на классические Ph-негативные формы заболевания. Однако при сохраняющейся типичной клинической картине ХМЛ отрицательный результат стандартного теста не исключает диагноз полностью: для окончательного исключения проводится цитогенетический анализ клеток костного мозга на наличие транслокации t(9;22)(q34;q11), а также дополнительные молекулярно-генетические исследования с применением FISH и расширенной ПЦР для выявления редких транскриптов BCR-ABL1, не входящих в стандартную панель. Такая углублённая оценка особенно обоснована при характерной клеточной картине крови, спленомегалии и других проявлениях миелопролиферативного процесса.

Тест представляет собой инструмент первичной диагностики и типирования, не предназначенный для количественного отслеживания ответа на лечение. После установления типа транскрипта дальнейшее наблюдение проводится отдельными количественными исследованиями того же транскрипта, и переход с диагностического этапа на этап мониторинга — обязательная часть ведения пациента с Ph-позитивным заболеванием.

Что влияет на результат анализа

На результат влияет качество доставленной матричной РНК: эта молекула быстро деградирует, поэтому к преаналитической подготовке предъявляются жёсткие требования по срокам, температурному режиму и типу пробирки. Биоматериалом служит периферическая кровь или костный мозг; при первичной диагностике предпочтительнее костный мозг как материал с большей долей патологических клеток, что повышает чувствительность исследования. Недавняя химиотерапия и таргетная терапия ингибиторами тирозинкиназы существенно снижают количество клеток, несущих BCR-ABL1, и могут давать отрицательный результат у пациента с подтверждённым диагнозом — в таких случаях интерпретация должна учитывать клинический контекст и историю лечения. Очень редкие нетипичные варианты транскрипта BCR-ABL1, выходящие за пределы стандартной диагностической панели, могут не определяться обычным набором праймеров и требуют расширенного исследования. Возраст пациента влияет на распределение типов транскриптов: p190 значительно чаще встречается у детей с Ph-позитивным ОЛЛ, тогда как у взрослых преобладает p210.