Анализ микробиоты по Осипову. Определение микробных маркеров методом газовой хроматографии–масс-спектрометрии.

Анализ микробиоты по Осипову – лабораторное исследование, основанное на определении микробных маркеров методом газовой хроматографии–масс-спектрометрии (ГХ-МС). Метод разработан российским микробиологом Георгием Андреевичем Осиповым (1939–2020), доктором биологических наук. В научной литературе исследование также обозначается как «масс-спектрометрия микробных маркеров» (МСММ) или «хромато-масс-спектрометрия микробных маркеров».

Метод базируется на том, что различные таксономические группы микроорганизмов обладают характерным набором структурных липидов клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. К таким маркерным соединениям относятся высшие жирные кислоты, разветвлённые жирные кислоты, гидроксикислоты, альдегиды, стерины.
Аналитический процесс включает несколько этапов: экстракцию липидных компонентов из биологического материала, кислотный метанолиз для получения метиловых эфиров жирных кислот, хроматографическое разделение и масс-спектрометрическую детекцию. Полученный хроматографический профиль сопоставляется с референсной базой данных микробных маркеров, на основании чего рассчитывается предполагаемая представленность микроорганизмов.

Отличия от других методов оценки микробиоты

Отличается от классического бактериологического посева тем, что метод ГХ-МС не требует культивирования микроорганизмов и позволяет выявлять труднокультивируемые и некультивируемые формы, включая облигатные анаэробы. В отличие от молекулярно-генетических методов (секвенирование гена 16S рРНК, метагеномный анализ), исследование не выявляет непосредственно нуклеиновые кислоты микроорганизмов, а оценивает химические маркеры, интерпретируемые как косвенные признаки их присутствия.

Определяемые группы микроорганизмов

Исследование позволяет оценить представленность микроорганизмов, характерных для соответствующего биотопа, с учётом их таксономической принадлежности и клинической значимости. Интерпретация результатов проводится с учётом локализации материала, количественных показателей и клинического контекста.

Резидентная (нормальная) микробиота

К данной группе относятся микроорганизмы, типично присутствующие в составе микробиоценоза соответствующего биотопа и участвующие в поддержании колонизационной резистентности, метаболических и иммунорегуляторных процессов.

Firmicutes (грамположительные бактерии с низким содержанием Г+Ц):

Lactobacillus spp — представители нормальной микробиоты кишечника и урогенитального тракта, продуценты молочной кислоты, поддерживают барьерную функцию слизистых оболочек.

Lactococcus spp — молочнокислые бактерии, могут присутствовать в составе микробиоты слизистых оболочек.

Eubacterium spp — облигатные анаэробы кишечника, участвуют в метаболизме желчных кислот и синтезе короткоцепочечных жирных кислот.

Clostridium spp (включая представителей кластеров C. coccoides и C. leptum) — многочисленная группа анаэробных бактерий кишечника, участвующих в ферментации сложных углеводов и формировании метаболического профиля микробиоты. Отдельные виды (C. difficile, C. perfringens, C. tetani) являются облигатными патогенами; их выявление требует клинической оценки, однако само по себе присутствие маркеров не является диагностическим критерием активной инфекции.

Ruminococcus spp — типичные представители кишечной микробиоты человека, участвуют в расщеплении сложных полисахаридов с образованием короткоцепочечных жирных кислот.

Peptostreptococcus spp — анаэробные кокки, могут входить в состав нормальной микробиоты слизистых оболочек.

Streptococcus spp — широко распространены в микробиоте ротоглотки, кишечника и урогенитального тракта; некоторые виды обладают условно-патогенными свойствами.

Staphylococcus spp (включая S. epidermidis) — типичные представители микробиоты кожи и слизистых; при нарушении барьерных механизмов способны вызывать инфекционные процессы.

Actinobacteria (грамположительные бактерии с высоким содержанием Г+Ц):

Bifidobacterium spp — ключевые представители кишечной микробиоты, участвуют в ферментации углеводов и синтезе короткоцепочечных жирных кислот; продуцируют бактериоцины.

Propionibacterium acnes (в современной номенклатуре — Cutibacterium acnes) — типичный представитель кожной микробиоты.

Propionibacterium freudenreichii — представитель резидентной микробиоты кишечника, применяется в качестве пробиотика; обладает иммуномодулирующими свойствами и способностью стимулировать рост бифидобактерий.

Actinomyces spp — анаэробы, колонизирующие слизистые оболочки полости рта и урогенитального тракта.

Eggerthella lenta — представитель кишечной микробиоты, способен участвовать в метаболической трансформации отдельных лекарственных препаратов.

Nocardia asteroides — актиномицет, в норме может выявляться в низких титрах; при иммунодефицитных состояниях способен вызывать оппортунистические инфекции.

Rhodococcus spp, Streptomyces spp, Corynebacterium spp — актинобактерии, входящие в состав нормальной микробиоты кожи и слизистых оболочек.

Bacteroidota (Bacteroidetes) и другие грамотрицательные анаэробы:

Bacteroides spp (включая Bacteroides fragilis) — одни из доминирующих представителей микробиоты толстой кишки; участвуют в метаболизме полисахаридов и иммунной регуляции.

Prevotella spp — грамотрицательные анаэробы, присутствуют в микробиоте кишечника и слизистых оболочек.

Fusobacterium spp — анаэробы, могут входить в состав микробиоты ротоглотки и кишечника; участвуют в формировании микробных ассоциаций.

Другие резидентные микроорганизмы:

Alcaligenes spp — грамотрицательные бактерии, могут присутствовать в составе микробиоты.

Условно-патогенные и транзиторные микроорганизмы

К данной группе относятся микроорганизмы, которые могут выявляться в составе микробиоты, однако их клиническая значимость определяется количественными показателями и клинической картиной.

Enterococcus spp — представители кишечной микробиоты; при избыточном росте или транслокации могут быть причиной инфекционных процессов.

Escherichia coli и другие представители сем. Enterobacteriaceae — факультативные анаэробы кишечника; отдельные штаммы обладают патогенными свойствами.

Helicobacter pylori — грамотрицательная бактерия, ассоциированная с хроническим гастритом и язвенной болезнью; выявление маркера требует клинической интерпретации.

Pseudomonas aeruginosa — условно-патогенный микроорганизм, чаще ассоциированный с нозокомиальными инфекциями.

Acinetobacter spp, Kingella spp — грамотрицательные бактерии, имеющие значение преимущественно в клиническом контексте инфекционной патологии.

Bacillus cereus — спорообразующая бактерия, может вызывать пищевые токсикоинфекции.

Микроскопические грибы

Candida spp — дрожжеподобные грибы, могут входить в состав микробиоты слизистых оболочек; при дисбалансе микробиоценоза и иммунных нарушениях способны вызывать кандидоз.

Aspergillus spp — мицелиальные грибы окружающей среды; клиническое значение определяется при инвазивных и аллергических формах инфекции.

Micromycetes (по маркерам стеролов) — выявляются по специфическим липидным маркерам; интерпретация проводится с учётом клинической ситуации и локализации материала.

Вирусы

Human alphaherpesvirus 1 и 2 — вирусы простого герпеса.

Human gammaherpesvirus 4 (Epstein–Barr virus) — широко распространённый персистирующий вирус.

Human betaherpesvirus 5 — цитомегаловирус.

Выявление вирусных маркеров не относится к оценке микробиоты как таковой и требует отдельной клинической интерпретации.

Дополнительные показатели

Плазмалогены — мембранные фосфолипиды, участвующие в регуляции окислительно-восстановительных процессов и метаболизме полиненасыщенных жирных кислот. Их изменения могут отражать метаболические особенности микробиоценоза и состояния тканей.

Эндотоксин (липополисахарид грамотрицательных бактерий) — компонент клеточной стенки, активирующий врождённый иммунный ответ через TLR4-зависимые механизмы. Повышение уровня может наблюдаться при повышенной проницаемости кишечного барьера, синдроме избыточного бактериального роста в тонкой кишке (СИБР), а также при системных воспалительных состояниях.

Клиническое применение

Метод ГХ-МС микробных маркеров не включён в клинические рекомендации международных гастроэнтерологических и микробиологических сообществ в качестве стандартного диагностического инструмента. С учётом указанных ограничений, исследование может рассматриваться как вспомогательный метод в следующих клинических ситуациях:

Гастроэнтерология:

• Функциональные расстройства ЖКТ (синдром раздражённого кишечника, функциональная диспепсия) при исключённой органической патологии
• Затяжное постинфекционное восстановление после верифицированных кишечных инфекций
• Антибиотик-ассоциированные нарушения (после исключения C. difficile-инфекции)
• Хронические воспалительные заболевания кишечника — в качестве дополнительного метода динамического наблюдения

Метаболические нарушения:

• Ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром — в рамках расширенного обследования

Иммунология:

• Рецидивирующие инфекции, иммунные дисфункции — как компонент комплексной оценки

Дерматология, урология, гинекология:

• Хронические воспалительные процессы соответствующих локализаций — при неэффективности стандартной терапии

Превентивная медицина:

• Оценка перед назначением пробиотической терапии или программ коррекции питания

Ограничения применения

Исследование не предназначено для:

• Диагностики острых кишечных инфекций
• Идентификации конкретных патогенов (Salmonella, Shigella, Campylobacter, C. difficile и др.)
• Определения антибиотикочувствительности
• Самостоятельного обоснования антибактериальной терапии

При подозрении на острую кишечную инфекцию необходимо выполнение бактериологического посева и/или ПЦР-диагностики патогенов.

Анализ микробиоты по Осипову (ГХ-МС) представляет собой инструментальный метод оценки микробных маркеров, позволяющий получить расширенную информацию о составе микробных сообществ различных биотопов. Метод может использоваться как вспомогательный инструмент в комплексной оценке состояния микробиоты, однако не является эквивалентом современного геномного профилирования и не должен рассматриваться как самостоятельное основание для постановки диагноза или назначения этиотропной терапии.